用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒，属于体外诊断技术领域。该试剂盒A包括：校准品、磁颗粒反应液Ra1、示踪结合物反应液Ra2和捕获抗体反应液Ra3。该试剂盒B包括：校准品、磁颗粒反应液Rb1、示踪结合物反应液Rb2和项目稀释反应液Rb3。该试剂盒C包括：校准品、磁颗粒反应液Rc1和示踪结合物反应液Rc2。本发明专利技术的试剂盒检测线性范围宽、灵敏度高、特异性好，该试剂盒为全自动化学发光仪器配套试剂，适用于血清和血浆中NSE的定量测定，本发明专利技术通过添加适量的Mg

Chemiluminescence immunoassay kit for detection of neuron-specific enolase

The invention provides a chemiluminescent immunoassay kit for detecting neuron specific enolase, belonging to the field of in vitro diagnosis technology. The kit A includes calibrator, magnetic particle reaction fluid Ra1, tracer conjugate reaction fluid Ra2 and capture antibody reaction fluid Ra3. The kit B includes calibrator, magnetic particle reaction liquid Rb1, tracer conjugate reaction liquid Rb2 and project dilution reaction liquid Rb3. The kit C includes calibrator, magnetic particle reaction liquid Rc1 and tracer conjugate reaction liquid Rc2. The kit of the invention has wide linear range, high sensitivity and good specificity. The kit is a complete reagent for automatic chemiluminescence instrument and is suitable for the quantitative determination of NSE in serum and plasma. The invention adds an appropriate amount of Mg.

【技术实现步骤摘要】
用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒
本专利技术属于体外诊断
，涉及一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒。
技术介绍
神经元特异性烯醇化酶(NSE)是烯醇化酶中的一种，在糖酵解过程中参与催化2-磷酸甘油酸转变成磷酸烯醇式丙酮酸，分子量为78KD，等电点为pH4.7，是一种酸性蛋白酶。烯醇化酶同工酶是由α、β、γ三种亚基以二聚体的形式组合而成，存在αα、αβ、ββ、αγ、γγ五种形式，其中α亚基主要存在于肝、肾等组织，二聚体αα被称为非神经元特异性烯醇化酶，β亚基为骨骼肌和心肌所特有，γ亚基为神经组织和神经内分泌组织所特有，二聚体γγ在神经元中表达，二聚体αγ在小胶质细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞中表达，因此二聚体αγ、γγ被称为NSE。NSE同时发挥炎症作用和神经营养活性作用，在神经元的生长、分化、存活和死亡过程中起着重要的调节作用。因大脑灰质含有大量的神经元，所以NSE在脑组织中的含量最高，占脑神经组织全部可溶性蛋白的1.5％-3％，占人脑皮质烯醇化酶的40％-60％，正常情况下，血清及脑脊液中含有微量的NSE，NSE异常增高与脑损伤、其它神经系统疾病以及肿瘤疾病相关，如脑出血、脑缺血、脑外伤、阿尔茨海默病、神经母细胞瘤、神经内分泌疾病(嗜铬细胞瘤、胰岛细胞瘤、甲状腺髓样癌、黑色素瘤等)和小细胞肺癌等。临床上，NSE主要应用于小细胞肺癌(SCLC)的诊断，它是SCLC最敏感、最特异的肿瘤标志物，NSE在SCLC患者血清中的水平明显高于非小细胞肺癌的患者(肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌等)，也可用于鉴别诊断。此外NSE也用于神经母瘤的诊断，它与S-100蛋白联合检测也被用于黑色素瘤的诊断。NSE在上述疾病的早期诊断和预后观察领域具有重要的临床价值。目前，市场上检验NSE的试剂盒主要分为酶联免疫法、化学发光免疫法和时间分辨荧光法等。传统的酶联免疫法自动化程度不高，受人为因素影响较大，不利于高通量的全自动化检测，特异性和灵敏度有待提高，未来会被自动化程度高的化学发光方法取代。目前进口主流NSE试剂是罗氏的产品，为电化学发光，其检测样本类型单一，只适用于血清样本的检测，血浆和血清样本测值存在较大的差异，所以提供一种血清和血浆样本通用的试剂即可以满足临床多种样本类型的需求，也可以减少病人的二次采样痛苦，另一方面也可以节约时间和经济成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有的检验NSE的试剂盒线性区间窄，且对血清和血浆样本的测值存在显著差异的问题，提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒。本专利技术提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒A，该试剂盒A包括：校准品、磁颗粒反应液Ra1、示踪结合物反应液Ra2和捕获抗体反应液Ra3；所述的磁颗粒反应液Ra1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；所述的示踪结合物反应液Ra2包含吖啶酯标记的NSE抗体、NaCl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的捕获抗体反应液Ra3包含生物素标记的NSE抗体、NaCl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。本专利技术还提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒B，该试剂盒B包括：校准品、磁颗粒反应液Rb1、示踪结合物反应液Rb2和项目稀释反应液Rb3；所述的磁颗粒反应液Rb1包含NSE抗体包被的磁珠、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的磁珠为羧基磁珠或对甲苯磺酰磁珠；所述的示踪结合物反应液Rb2包含吖啶酯标记的NSE抗体、NaCl、MgCl2、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的项目稀释反应液Rb3包含缓冲液NaCl、MgCl2、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。本专利技术还提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒C，该试剂盒C包括：校准品、磁颗粒反应液Rc1和示踪结合物反应液Rc2；所述的磁颗粒反应液Rc1包含NSE抗体包被的磁珠、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的磁珠为羧基磁珠或对甲苯磺酰磁珠；所述的示踪结合物反应液Rc2包含吖啶酯标记的NSE抗体、NaCl、MgCl2、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。优选的是，所述的试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C中，所述的校准品浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/mL，校准品基质配方为pH7.4的磷酸缓冲液(PB)，0.15mol/L氯化钠(NaCl)，质量浓度为5％的牛血清白蛋白(BSA)。优选的是，所述的试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C中，所述的防腐剂为NaN3、Proclin300或Proclin950，所述的防腐剂的质量浓度为0.01％-1％。优选的是，所述的试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C中，所述的蛋白稳定剂为BSA、酪蛋白或BGG中的一种或几种，所述的蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％。优选的是，所述的试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C中，所述的表面活性剂为吐温、聚乙二醇或者曲拉通，所述的表面活性剂的质量浓度为0.01％-1％。优选的是，所述的试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C中，吖啶酯标记的NSE抗体的制备方法，包括：在避光条件下，取NSE抗体和吖啶酯溶液按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间1-12小时。优选的是，所述的试剂盒A中，生物素标记的NSE抗体的制备方法，包括：在避光条件下，取NSE抗体和生物素溶液按照摩尔浓度1:(1-50)的比例进行标记，标记缓冲液为pH7.4PB，标记时间2-24h。优选的是，所述的试剂盒B、试剂盒C中，NSE抗体包被的磁珠的制备方法，包括：当磁珠为羧基磁珠时，取羧基磁珠用缓冲液清洗，然后重悬至缓冲液中，加入NSE抗体和碳二亚胺盐酸盐混匀，NSE抗体用量为磁珠质量的0.1％-10％，在室温下活化悬混反应2-18小时，得到NSE抗体包被的磁珠；当磁珠为对甲苯磺酰磁珠时，取对甲苯磺酰磁珠用缓冲液清洗，然后重悬至缓冲液中，同时加入NSE抗体和硫酸铵混匀，NSE抗体用量为磁珠质量的0.1％-10％，硫酸铵反应浓度为1.2mol/L，在37℃条件下活化悬混反应10-36小时，得到NSE抗体包被的磁珠。本专利技术的原理因为NSE分子γ亚基的三维结构包括大约300个氨基酸组成8个α/β桶状结构，其中β折叠位于桶状结构的核心部位，为NSE的活性位点所在，周围环绕a螺旋。酶活性中心主要由以下三种碱性氨基酸组成：组氨酸-189、精氨酸-371和赖氨酸-393。NSE所有抗原决定簇都分布在48～96、188～293、399～433氨基酸序列区，位于其三维结构表面，在免疫反应中可刺激机体产生NSE的单克隆抗体。人类的NSE二聚体是不对称的复合物，其中一个亚基含有硫酸根离子和两个镁离子是闭合的构象，可观察到该亚基结合有酶底物或其类似物。而另一个亚基没有结合任何底物或类似物呈开放的构象。EDTA血浆样本因样本管中添加了EDTA，EDTA与镁离子的结合能力强，从而会破坏NSE分子与Mg2+离子的结合，进而影响NSE分子构象，直接或间接的影响抗原结合位点，影响免疫反应。所以本专利技术在配方中添加过量的Mg2+离子，与EDTA过饱和结合，从而不影响NSE抗原分子的构像本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒，其特征在于，命名为试剂盒A，该试剂盒A包括：校准品、磁颗粒反应液Ra1、示踪结合物反应液Ra2和捕获抗体反应液Ra3；所述的磁颗粒反应液Ra1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；所述的示踪结合物反应液Ra2包含吖啶酯标记的NSE抗体、NaCl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的捕获抗体反应液Ra3包含生物素标记的NSE抗体、NaCl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒，其特征在于，命名为试剂盒A，该试剂盒A包括：校准品、磁颗粒反应液Ra1、示踪结合物反应液Ra2和捕获抗体反应液Ra3；所述的磁颗粒反应液Ra1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；所述的示踪结合物反应液Ra2包含吖啶酯标记的NSE抗体、NaCl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的捕获抗体反应液Ra3包含生物素标记的NSE抗体、NaCl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。2.一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒，其特征在于，命名为试剂盒B，该试剂盒B包括：校准品、磁颗粒反应液Rb1、示踪结合物反应液Rb2和项目稀释反应液Rb3；所述的磁颗粒反应液Rb1包含NSE抗体包被的磁珠、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的磁珠为羧基磁珠或对甲苯磺酰磁珠；所述的示踪结合物反应液Rb2包含吖啶酯标记的NSE抗体、NaCl、MgCl2、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的项目稀释反应液Rb3包含缓冲液NaCl、MgCl2、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。3.一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒，其特征在于，命名为试剂盒C，该试剂盒C包括：校准品、磁颗粒反应液Rc1和示踪结合物反应液Rc2；所述的磁颗粒反应液Rc1包含NSE抗体包被的磁珠、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的磁珠为羧基磁珠或对甲苯磺酰磁珠；所述的示踪结合物反应液Rc2包含吖啶酯标记的NSE抗体、NaCl、MgCl2、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。4.根据权利要求1-3任何一项所述的一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C中，所述的校准品浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/mL，校准品基质配方为pH7.4的磷酸缓冲液，0.15mol/L氯化钠，质量浓度为5％的牛血清白蛋白。5.根据权利要求1-3任何一项所述的一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒A...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟令敏，李磊，王凯，孙成艳，高威，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22