神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，属于体外检测技术领域。该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗粒悬浮液、化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。本发明专利技术提供一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。本发明专利技术的神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守，缩短了临床检测所需的时间，同时检测精度较高，试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。

Neuron-specific enolase chemiluminescence immunoassay kit and its preparation method

The invention provides a neuron specific enolase chemiluminescence immunoassay kit and a preparation method thereof, belonging to the field of in vitro detection technology. The kit includes streptavidin magnetic particle suspension, neuron specific enolase monoclonal antibody labeled with chemiluminescent marker and neuron specific enolase monoclonal antibody labeled with coupling marker. The invention provides a preparation method of a neuron specific enolase chemiluminescence immunoassay kit. The neuron-specific enolase chemiluminescence immunoassay kit of the invention is a fully automatic measurement sample, and directly gives the numerical value, reduces the error of human operation, realizes unattended, shortens the time needed for clinical detection, and has high detection accuracy. The reagent and instrument constitute a closed system with small system error.

【技术实现步骤摘要】
神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
本专利技术属于体外检测
，涉及一种神经元特异性烯醇化酶(NSE)化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
NSE是神经元及神经内分泌细胞三羧酸循环过程中催化2-磷酸甘油酸变成磷酸烯醇式丙酮酸的关键酶。基因核苷酸序列全长2423bp，编码434个氨基酸残基，生物半衰期可能大于20h，分子量为78kD，等电点pH4.7，是一种酸性蛋白酶。NSE是烯醇化酶基因家族成员之一，烯醇化酶是由α、β、γ三个亚基组成的二聚体，其同工酶分为αα、ββ、γγ、αγ和αβ五种。α亚基主要存在于肝、肾等组织，故称为非神经系统的烯醇化酶(NNE)；β亚基主要存在于骨骼肌和心肌，称为肌肉特异性的烯醇化酶(MSE)；γ亚基主要存在于神经组织，γγ、αγ组成的同工酶为神经元和神经内分泌细胞特有，故命名为神经元特异性烯醇化酶(neuro-specificenolase，NSE)。在临床应用方面，NSE主要作为中枢神经系统损害的标志物，其分泌的动态变化可预示神经系统损伤的敏感性和特异性。常用于肿瘤诊断、监测治疗效果及预后评估等。多种中枢神经系统疾病如脑损伤、脑肿瘤、视网膜损伤、以及其他原因引起的脑损伤中，血中NSE浓度都会出现不同程度的升高，NSE可作为损伤的敏感性和特异性指标。NSE是用于小细胞肺癌诊断的、具有高特异性和高灵敏性的肿瘤标记物，其特异性高达80％～90％。可用于鉴别诊断，监测小细胞肺癌放疗、化疗后的治疗效果。用神经元特异性烯醇化酶监测小细胞肺癌的复发，比临床确定复发要早4～12周；神经元特异性烯醇化酶还可用于神经母细胞瘤和肾母细胞瘤的鉴别诊断，并且监测神经母细胞瘤的病情变化，评价疗效和报告复发；NSE在内分泌肿瘤中显示出很高的免疫活性，并且可以在血清中直接检出，因此可以用来监测肿瘤患者的病情进展，评价治疗效果。血清学检测比放射线检查、解剖学检查方便迅速，因此NSE作为肿瘤标记物在临床中的应用十分广泛。目前我国获准上市的国产及进口试剂盒检测原理主要有酶联免疫法(ELISA)、电化学发光免疫法(ECLI)、时间分辨免疫荧光法(TRFIA)和化学发光免疫法(CLIA)。传统的酶联免疫法不仅操作繁琐，自动化程度低，受人为因素影响大，而且特异性及灵敏性都有待提高。电化学发光免疫法(ECLI)、时间分辨免疫荧光法(TRFIA)和化学发光免疫法(CLIA)具有灵敏度高、线性范围宽、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验分析手段。但是目前临床上检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)主要以国外进口试剂为主，国外进口试剂价格昂贵，货期长，给患者带来沉重的经济负担及诸多不便，不利于在基层医院推及。化学发光免疫测定技术是一种高度敏感的微量测定技术，具备敏感性高、特异性强、测定范围宽、试剂稳定性好、操作简便等特点。目前基于化学发光免疫分析原理的检测仪器已成功商品化，如雅培诊断公司(Abbott)的ARCHITECT(i)型化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒，采用吖啶酯标记抗体作为检测探针，抗体包被磁珠为反应载体，并结合自动化的检测系统，可快速检测多种疾病标志物。但是基于化学发光免疫技术用于检测NSE的国产试剂盒的研究相对较少，不能满足国内需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有的检测NSE的方法检测时间长、灵敏度低、重复性差的问题，而提供一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。本专利技术首先提供一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗粒悬浮液化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。优选的是，所述的试剂盒中，链霉亲和素磁颗粒悬浮液质量百分比为0.01％～1％。优选的是，所述链霉亲和素磁颗粒悬浮液中，链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm。优选的是，所述化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体中，神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体与化学发光标记物摩尔比为1:(1～20)，化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的浓度为≥0.1μg/mL。优选的是，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。优选的是，所述偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体中，神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:(1～20)，偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/mL。优选的是，所述偶联标记物为生物素。优选的是，所述的试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液。优选的是，所述的试剂盒还包括神经元特异性烯醇化酶校准品，所述神经元特异性烯醇化酶校准品为浓度分别为0.00ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL和500ng/mL的神经元特异性烯醇化酶溶液。本专利技术还提供上述的神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂；步骤二：化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的制备将神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体放入离心管中离心，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，将封闭好的抗体经过纯化、收集，然后放入缓冲液中稀释，保存；步骤三：偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的制备将神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体放入离心管中离心，然后加入TRIS缓冲液，混匀后加入偶联标记物溶液离心，标记反应后加入赖氨酸继续反应，最后将反应液用脱盐柱纯化、收集后放入缓冲液中稀释，保存。本专利技术的有益效果本专利技术首先提供一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒以链霉亲和素磁颗粒悬浮液作为固相载体，双抗体夹心原理进行检测，结合发光强度和灵敏度都较高的化学发光物质对NSE进行标记，采用过氧化氢化学发光体系，以双抗体夹心法实现对NSE的定量检测，该试剂盒选择吖啶酯为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本；采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的类似物可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。本专利技术的神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守，缩短了临床检测所需的时间，同时检测精度较高，试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。附图说明图1为实施例5得到的NSE标准曲线。具体实施方式为了使本专利技术的优点、目的和方法更加详实易懂，下面结合附图和具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了诸多细节以便于理解，但本专利技术可以以不同与描述的其他方式来实施。本专利技术首先提供一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗粒悬浮液化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗粒悬浮液化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中，链霉亲和素磁颗粒悬浮液质量百分比为0.01％～1％。3.根据权利要求1所述的一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁颗粒悬浮液中，链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm。4.根据权利要求1所述的一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体中，神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体与化学发光标记物摩尔比为1:(1～20)，化学发光标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的浓度为≥0.1μg/mL。5.根据权利要求1或4所述的一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。6.根据权利要求1所述的一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体中，神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:(1～20)，偶联标记物标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/mL。7.根据权利要求1或6所述的一种神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记物为生物素。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：李磊，孟令敏，王凯，孙成艳，高威，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22