一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测水产病害金标核酸试纸条。包括样品垫、含有探针Probe1‑AuNPs复合物的金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上分别吸附有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’。本发明专利技术开发以纳米金核酸探针作为标记物、通过薄膜层析手段检测灿烂弧菌，为灿烂弧菌的病害防控提供简便快捷有效的检测方法。

A Gold Label Nucleic Acid Test Strip for Rapid Detection of Aquatic Diseases and Its Preparation Method

The invention relates to a gold standard nucleic acid test strip for rapid detection of aquatic diseases. A sample pad, a gold pad containing probe1 AuNPs complex, a cellulose nitrate membrane and a water absorbent pad are included; a detection line and a quality control line are adsorbed on the cellulose nitrate membrane separately; the detection line is composed of probe2, the quality control line is composed of probe1'; the probe1 and Probe2 are: from the virulence gene sequence of Vibrio brilliant. Probe 1 and Probe 2 are designed with their 5'and 3' ends respectively, then Probe 1 is designed with its complementary sequence according to Probe 1'. The invention develops a nano gold nucleic acid probe as a marker to detect Vibrio brilliant by means of thin film chromatography, and provides a simple, fast and effective detection method for disease prevention and control of Vibrio brilliant.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法。
技术介绍
灿烂弧菌（Vibriosplendidus）为弧菌科，弧菌属，是海水养殖动物的主要致病菌之一，可感染鱼类、棘皮动物、双壳贝类和甲壳类等宿主，导致水产养殖病害的发生。由其引发的刺参腐皮综合征能导致刺参嘴肿、厌食、体表溃烂、身体萎缩、排脏等病理反应，最终导致刺参死亡，给水产养殖带来巨大的经济损失。尽早检测与诊断该病原菌是有效预防该类疾病发生的有效手段，因此，研究开发快速准确的病原检测技术非常重要。目前针对灿烂弧菌的检测方法主要有常规微生物检测技术、基于分子生物学的检测方法（PCR法、斑点杂交等）和基于免疫学的检测方法（荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验、胶体金标抗体的免疫层析试纸条等）。但这些方法存在诸多的缺点和不足：传统的病原菌培养及生理生化检测需要经过分离培养、形态观察、生理生化指标鉴定等，耗时耗力，精度和可靠性有限；基于分子生物学技术的检测方法虽然检测快速、灵敏度高，但容易出现假阳性，并且需要专业技术人员和特殊仪器设备，限制了其在水产养殖业的推广应用；基于免疫学的检测方法是较为简便的检测方法，但都离不开单克隆抗体的制备，而单克隆抗体制备工艺复杂、生产周期长，成为此检测手段开发的瓶颈。
技术实现思路
为解决上述现有技术的不足，本专利技术提供一种简便快捷的水产病原菌灿烂弧菌的金标核酸快速检测试纸条。本专利技术提供一种快速检测水产病害金标核酸试纸条，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有探针Probe1-AuNPs复合物的金标垫、与所述金标垫紧密连接的硝酸纤维素膜和紧密连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，其中Probe1的5’端有巯基修饰，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’，所述的探针Probe1、Probe2和Probe1’的基因组序列为：Probe1：5’-SHAAAAAAGCGGAGCCGCCTGCCGAGTC-3’；Probe2：5’-ACCCTCCACTATGTATAGTT-3’；Probe1'：5’-GACTCGGCAGGCGGCTCCGC-3’。本专利技术还提供一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤包括：（1）Probe1-AuNPs复合物的制备：将80-120µL纳米金溶液和20-40µL的1-10μmol/L的probe1混匀反应，再加入混合液继续反应，经离心收集纳米金颗粒；用混合液漂洗、重悬后，最终得到Probe1-AuNPs复合物；所述混合液是NaCl和PB的混合液，所述NaCl浓度为0.05-0.50mol/L，所述PB浓度为8-12mmol/L；（2）将步骤（1）制备的AuNPs-DNA复合物加到玻璃纤维上，制备金标垫；（3）将处理后的硝酸纤维素膜上划上probe2作为检测线，另一端划上Probe1’作为质控线，检测线和质控线之间的间隔为5.0-6.0mm；（4）按照如上述的金标核酸试纸条的结构黏贴好样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，组装完成后，在室温下用重物压实，裁切、密封干燥保存，得到金标核酸试纸条。进一步的，所述步骤（1）PBS缓冲液的pH值为7.0。本专利技术还提供一种快速检测水产病原菌灿烂弧菌的方法，所述方法包括：以分离病原菌灿烂弧菌裂解液或水产品病灶组织裂解液为样品滴加在如上述的金标核酸试纸条上进行检测，根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读：若检测线和质控线同时显示红色，则结果为阳性；若检测线不显色，质控线显示红色，则结果判定为阴性；若质控线不显色，则检测无效。有益效果：本专利技术在胶体金标抗体检测试纸条的基础上开发了一种新型检测试纸条，打破了试纸条对抗体的依赖，以人工合成核酸探针代替抗体，基于核酸分子杂交技术，开发以纳米金核酸探针作为标记物，通过薄膜层析手段检测灿烂弧菌，为灿烂弧菌的病害防控提供简便、快捷、有效的检测方法。本专利技术制备工艺简便，生产成本低廉，反应结果不需要借助特殊设备，用肉眼直接判定，能满足广大水产养殖户的需要，易于大范围推广应用。附图说明图1为本专利技术试纸条的结构示意图；图2为本专利技术试验例1中检测灵敏度的实验结果图；图3为本专利技术试验例2中检测特异性的实验结果图。具体实施方式实施例1一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤包括：（1）Probe1-AuNPs复合物的制备：将10mL纳米金溶液浓缩成100µL后加入30µL10μmol/L的probe1,充分混匀，在避光条件下，4℃静置12-24h，加入0.3mol/LNaCl和10mmol/LPB(pH7.0)的混合液1mL，充分混匀，4℃静置24-72h，4℃、12000r/min离心6min，以收集纳米金颗粒。弃上清，用0.3mol/LNaCl和10mmol/LPB(pH7.0)的混合液1mL漂洗，4℃、12000r/min离心5min以去除多余的寡核苷酸探针。弃上清，最后用100μl含0.3mol/LNaCl和10mmol/LPB(pH7.0)的混合液重悬沉淀，4℃避光保存；（2）将25µl的步骤（1）制备的AuNPS-DNA复合物加到玻璃纤维上制备金标垫，在室温下避光干燥过夜，保存在4℃干燥器中待用；（3）将硝酸纤维素膜在10mMPBS缓冲液中浸泡5-10min，并在30-40℃下干燥2-3h；在浸泡后的硝酸纤维素膜上划上probe2做为检测线，另一端划上Probe1’做为质控线，紫外灯下交联2h，并保存于4℃干燥器中待用；检测线和质控线之间的间隔为5.0-6.0mm；（4）将吸水垫在10mMPBS缓冲液中浸泡5min，在37℃下干燥2h；（5）将样品垫在处理缓冲液中浸泡1h，并在37℃下干燥2h；（6）最后按照如图1所示的金标核酸试纸条的结构黏贴好样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，组装完成后，在室温下用重物压实，裁切、密封干燥保存，得到金标核酸试纸条。最后以分离病原菌灿烂弧菌裂解液或水产品病灶组织裂解液为样品滴加在如上述的金标核酸试纸条上进行检测，根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读：若检测线和质控线同时显示红色，则结果为阳性；若检测线不显色，质控线显示红色，则结果判定为阴性；若质控线不显色，则检测无效。所述的探针Probe1、Probe2为：对数据库中查找到的20条灿烂弧菌菌株的毒力基因序列进行同源性分析，从中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，其中Probe1的5’端有巯基修饰，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’，所述的探针Probe1、Probe2和Probe1’的基因组序列为：Probe1：5’-SHAAAAAAGCGGAGCCGCCTGCCGAGTC-3’；Probe2：5’-ACCCTCCACTATGTATAGTT-3’；Probe1'：5’-GACTCGGCAGGCGGCTCCGC-3’。所述步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测水产病害金标核酸试纸条，其特征在于，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有探针Probe1‑AuNPs复合物的金标垫、与所述金标垫紧密连接的硝酸纤维素膜和紧密连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，其中Probe1的5’端有巯基修饰，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’，所述的探针Probe1、Probe2和Probe1’的基因组序列为：Probe1：5’‑SHAAAAAAGCGGAGCCGCCTGCCGAGTC‑3’；Probe2：5’‑ACCCTCCACTATGTATAGTT‑3’；Probe1'：5’‑GACTCGGCAGGCGGCTCCGC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测水产病害金标核酸试纸条，其特征在于，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有探针Probe1-AuNPs复合物的金标垫、与所述金标垫紧密连接的硝酸纤维素膜和紧密连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，其中Probe1的5’端有巯基修饰，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’，所述的探针Probe1、Probe2和Probe1’的基因组序列为：Probe1：5’-SHAAAAAAGCGGAGCCGCCTGCCGAGTC-3’；Probe2：5’-ACCCTCCACTATGTATAGTT-3’；Probe1'：5’-GACTCGGCAGGCGGCTCCGC-3’。2.一种如权利要求1所述的快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，其特征在于，步骤包括：（1）Probe1-AuNPs复合物的制备：将80-120µL纳米金溶液和20-40µL的1-10μmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，宿红艳，张力支，石雪燕，吴桂芬，李玉洁，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37