利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法技术

利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，涉及哈维氏弧菌的荧光标记和显微识别方法。待测样品处理；核酸适配体处理；核酸适配体与菌的结合和洗涤；涂片、固定和染色；荧光显微镜观察。将具有特异性识别哈维氏弧菌的适配体进行荧光标记，然后通过洗涤、染色等步骤，最后通过荧光显微镜实现对哈维氏弧菌的可视化显微识别和鉴定。利用核酸适配体对哈维氏弧菌的特异性识别作用，通过对适配体进行荧光标记，进而实现对哈维氏弧菌的荧光标记，然后通过荧光显微镜来观察核酸适配体与目标菌结合后的荧光，实现对哈维氏弧菌的显微识别和鉴定。

Fluorescence labeling and microscopic identification of Vibrio harveyi using aptamers

The method of fluorescent labeling and microscopic identification of Vibrio harveyi using adapters involves fluorescent labeling and microscopic identification of Vibrio harveyi. Sample processing; nucleic acid aptamer processing; nucleic acid aptamer binding and washing with bacteria; smear, fixation and staining; fluorescence microscopy observation. Vibrio harveyi was identified by fluorescent labeling of the adapters with specific recognition. Then, the visual microscopic identification and identification of Vibrio harveyi were realized by washing and dyeing steps, and finally by fluorescence microscopy. Using the specific recognition function of nucleic acid aptamers to Vibrio harveyi, the fluorescence labeling of Vibrio harveyi was realized by fluorescence labeling of aptamers. Then the fluorescence of the aptamers combined with the target bacteria was observed by fluorescence microscopy to realize the microscopic identification and identification of Vibrio harveyi.

【技术实现步骤摘要】
利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法
本专利技术涉及一种哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)的荧光标记和显微识别方法，尤其是涉及利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法。
技术介绍
中国水产养殖为世界水产业的发展做出了巨大的贡献。但随着海水养殖业迅速发展和集约化养殖规模的逐渐扩大，海水养殖病害也呈多发趋势，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，而且相当多的疾病为弧菌感染所导致。因此建立病原弧菌的早期快速检测技术，对预防相应病害的发生和流行就显得极其重要。哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，极生单鞭毛运动。它广泛存在于海洋环境中，是水产养殖中重要的条件致病菌，主要感染对象是对虾和鱼等，并可通过食物链引起人类食物中毒，危害人类健康。核酸适配体(Aptamer)是利用体外筛选技术——指数富集配体的系统进化技术(SystemicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)，从核酸分子文库中筛选得到的寡核苷酸片段。经过研究发现，核酸适配体可以折叠成一定的三维空间立体结构，比如：假结、发卡、G-四链体、鼓包等。核酸适配体利用这些特殊的结构位点，通过静电作用、氢键作用、堆积作用、疏水作用和形状匹配等多种相互作用力，能够与靶标物质形成高亲和力复合物，从而实现对靶标物质的特异性识别结合。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供操作简单，检测快速，大大缩短检测周期，在水产病原弧菌快速检测中具有较好应用前景的利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法。本专利技术的具体步骤如下：1)待测样品处理；在步骤1)中，所述待测样品处理的具体方法可为：取待测菌悬液样品，6000rpm离心5min，去除上清后用0.9％生理盐水洗涤菌沉淀1次，然后用0.9％生理盐水重悬菌沉淀。2)核酸适配体处理；在步骤2)中，所述核酸适配体处理的具体方法可为：取已在5′端标记了荧光基团的哈维氏弧菌的核酸适配体，用2×结合缓冲液稀释配制成3.33nmol/L的溶液，然后在95℃变性30min，再冰浴10min，所述2×结合缓冲液可将20×结合缓冲液用超纯水稀释20倍所得，所述20×结合缓冲液的配制方法如下：分别称取3.725g的氯化钾、5.844g的氯化钠、2.033g的六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)和6.06g的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，然后将称量的物质用超纯水定容至100ml，调节混合溶液的pH值至7.4，再放入4℃冰箱储存、备用；所述5′端标记了荧光基团可为荧光基团异硫氰酸荧光素。3)核酸适配体与菌的结合和洗涤；在步骤3)中，所述核酸适配体与菌的结合和洗涤的具体方法可为：取100μl稀释处理好的适配体分别与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合结合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀得到结合了适配体的待测菌悬液；同时做一空白对照，即取100μl的2×结合缓冲液(代替原来的适配体)，与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀，即可得到未结合适配体的空白对照菌悬液。4)涂片、固定和染色；在步骤4)中，所述涂片、固定和染色的具体方法可为：从步骤3)结合适配体的待测菌悬液和未结合适配体的空白菌悬液中分别取相同量的1～10μl菌液涂布于载玻片上，避光干燥后，用酒精灯轻微加热，使菌固定，可见载玻片中央有白色的菌，然后分别向两种载玻片中滴加50μl0.05g/ml的番红染液，染色2min，然后水洗，载玻片用滤纸吸干，避光干燥，最后在荧光显微镜下观察；所述两种载玻片包括涂布1～10μl菌液的载玻片和中央有白色菌的载玻片。5)荧光显微镜观察。在步骤5)中，所述荧光显微镜观察的具体方法可为：空白对照载玻片在显微镜的可见光下(明场下)可看到相应的细菌带，但在荧光下视野中均为黑暗、无荧光亮点；而与适配体进行结合处理后的待测菌载玻片在显微镜的可见光下(明场下)也可看到相应的细菌带，在荧光下如果相应的细菌带都出现明显的、大量的荧光亮点，说明该待测菌为哈维氏弧菌；如果相应的细菌带没有出现较明显的、大量的荧光亮点，说明该待测菌不是哈维氏弧菌。本专利技术将具有特异性识别哈维氏弧菌的适配体进行荧光标记，然后通过洗涤、染色等步骤，最后通过荧光显微镜实现对哈维氏弧菌的可视化显微识别和鉴定。与现有的哈维氏弧菌的识别标记技术相比较，本专利技术利用了核酸适配体对哈维氏弧菌的特异性识别作用，通过对适配体进行荧光标记，进而实现对哈维氏弧菌的荧光标记，然后通过荧光显微镜来观察核酸适配体与目标菌结合后的荧光，实现对哈维氏弧菌的显微识别和鉴定。附图说明(各图均是在荧光显微镜40倍镜下的图片)图1为哈维氏弧菌的明场图。图2为哈维氏弧菌的荧光图。图3为与核酸适配体结合后的哈维氏弧菌的明场图。图4为与核酸适配体结合后的哈维氏弧菌的荧光图。图5为与核酸适配体结合后溶藻弧菌的明场图。图6为与核酸适配体结合后溶藻弧菌的荧光图。具体实施方式以下实施例将结合附图对本专利技术作进一步的说明。本专利技术实施例的具体步骤如下：1)待测样品处理：取待测菌悬液样品，常温下6000rpm离心5min，去除上清后用0.9％生理盐水洗涤菌沉淀1次，然后用0.9％生理盐水重悬菌沉淀。2)核酸适配体的处理：取已在5′端标记了荧光基团(如异硫氰酸荧光素)的哈维氏弧菌的核酸适配体，用2×结合缓冲溶液稀释配制成3.33nmol/L的溶液，然后在95℃变性30min，再冰浴10min。所述20×结合缓冲液配制：分别称取3.725g的氯化钾，5.844g的氯化钠，2.033g的六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)和6.06g的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，然后将称量的物质用超纯水定容至100ml，调节混合溶液的pH值至7.4，即可将其放入4℃冰箱储存、备用。2×结合缓冲液是将20×结合缓冲液用超纯水稀释20倍所得。3)结合和洗涤：取100μl稀释处理好的适配体分别与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中结合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀得到结合了适配体的待测菌悬液。同时做一空白对照，即取100μl的2×结合缓冲液(代替原来的适配体)，与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀，得到未结合适配体的空白对照菌悬液。同时按同样方法做一空白对照，即用2×结合缓冲液代替适配体，与待测菌液混合，按同样的方法进行结合、离心、洗涤和重悬，得到未结合适配体的空白对照菌液。4)涂片、固定和染色：从上述结合了适配体的待测菌悬液和未结合适配体的空白菌悬液中分别取一定量的菌液涂布于载玻片上，避光干燥后，用酒精灯轻微加热，使菌固定，此时可见玻片中央有白色的菌。然后分别向两本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于其具体步骤如下：1)待测样品处理；2)核酸适配体处理；3)核酸适配体与菌的结合和洗涤；4)涂片、固定和染色；5)荧光显微镜观察。

【技术特征摘要】
1.利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于其具体步骤如下：1)待测样品处理；2)核酸适配体处理；3)核酸适配体与菌的结合和洗涤；4)涂片、固定和染色；5)荧光显微镜观察。2.如权利要求1所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于在步骤1)中，所述待测样品处理的具体方法为：取待测菌悬液样品，6000rpm离心5min，去除上清后用0.9％生理盐水洗涤菌沉淀1次，然后用0.9％生理盐水重悬菌沉淀。3.如权利要求1所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于在步骤2)中，所述核酸适配体处理的具体方法为：取已在5′端标记了荧光基团的哈维氏弧菌的核酸适配体，用2×结合缓冲液稀释配制成3.33nmol/L的溶液，然后在95℃变性30min，再冰浴10min，所述2×结合缓冲液将20×结合缓冲液用超纯水稀释20倍所得，所述20×结合缓冲液的配制方法如下：分别称取3.725g的氯化钾、5.844g的氯化钠、2.033g的六水合氯化镁和6.06g的三羟甲基氨基甲烷，然后将称量的物质用超纯水定容至100ml，调节混合溶液的pH值至7.4，再放入4℃冰箱储存、备用。4.如权利要求3所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于所述5′端标记了荧光基团为荧光基团异硫氰酸荧光素。5.如权利要求1所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于在步骤3)中，所述结合和洗涤的具体方法为：取100μl稀释处理好的适配体分别与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合结合30min，然后6000r...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑江，彭英林，鄢庆枇，刘慧敏，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建,35