一种用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及食品安全检测技术领域，特别涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该定性定量免疫层析试纸条，在底板上依次搭接设置有滤纸、样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸；玻璃纤维膜上附着有胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，检测线上包被有荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原，质控线上包被有第二抗体。本发明专利技术双显色体系对检测样本中的黄曲霉毒素B1同时实现定性和定量检测，样本结果在检测中得到双体系验证，结果更加可靠，节约检测时间。

A qualitative and quantitative immunochromatographic strip for aflatoxin B1 detection and its preparation method and Application

The invention relates to the technical field of food safety detection, in particular to a qualitative and quantitative immunochromatographic strip for detecting aflatoxin B1, a preparation method and application thereof. The qualitative and quantitative immunochromatographic strip is successively overlapped with filter paper, sample pad, glass fiber membrane, nitrate cellulose membrane and absorbent paper on the bottom plate; the glass fiber membrane is attached with colloidal gold labeled aflatoxin B1 monoclonal antibody; the nitrocellulose membrane is equipped with detection line and quality control line, and the detection line is coated with aflatoxin B1 artificial antigen labeled by fluorescent microspheres. The quality control line is coated with a second antibody. The dual-color system realizes both qualitative and quantitative detection of aflatoxin B1 in the detection sample, and the sample results are verified by the dual-color system in the detection, so the results are more reliable and the detection time is saved.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条及其制备方法和应用
本专利技术涉及食品安全检测
，特别涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
黄曲霉毒素(aflatoxinB1，称AFB1)是真菌的次级代谢产物，主要是由黄曲霉、寄生曲霉和特曲霉产生。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻谷等农作物中，具有强烈的毒性和致癌性。它是目前化学致癌物中最强的一种致癌诱变剂，其毒性比氰化钾强10倍，其致癌性比二甲基亚硝胺强75倍。1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物，其作用的靶器官主要为肝脏。对于谷物及其制品，玉米、玉米面(渣、片)及玉米制品中黄曲霉毒素B1的限量标准为20μg/kg，稻谷、糙米、大米为10μg/kg，小麦、大麦、其他谷物为5.0μg/kg，小麦粉、麦片、其他去壳谷物为5.0μg/kg；对于豆类及其制品，发酵豆制品中黄曲霉毒素B1的限量标准为5.0μg/kg；对于坚果及其籽类，花生及其制品中黄曲霉毒素B1的限量标准为20μg/kg，其他熟制坚果及其籽类为5.0μg/kg；对于油脂及其制品，植物油脂(花生油、玉米油除外)中黄曲霉毒素B1的限量标准为10μg/kg，花生油、玉米油为5.0μg/kg；对于调味品，酱油、醋、酿造醋(以粮食为主要原料)中黄曲霉毒素B1的限量标准为5.0μg/kg。目前，现行的食品安全国家标准食品中第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的测定。第二法为高效液相色谱-柱前衍生法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的测定。第三法为高效液相色谱-柱后衍生法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的测定。第四法为酶联免疫吸附筛选法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFB1的测定。第五法为薄层色谱法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品中AFB1的测定。免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，由于抗原抗体结合的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测线)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验结果(如检测线出现不同颜色的条带)；而游离标记物则越过检测线，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的目测标记载体有胶体金、乳胶、胶体硒等，其中运用最成功的标记物为胶体金。但是，胶体金免疫层析试纸条存在以下缺陷：⑴一般试纸条均为通过肉眼观察结果进行定性分析，无法实现精准的定量检测。⑵不同的材料基质效应明显，样本背景干扰较大，易产生假阳性结果。⑶检测的阳性结果无法保存，通常超过判断时间后，结果不再准确可靠。市场为了满足对样本进行定量检测的需求，各种基于不同标记物的定量检测试纸条也层出不穷，一般目前的定量检测试纸条，都是单一的标记物标记抗体后，通过小型仪器读取显色信号值，再通过绘制标准曲线进行定量检测。目前基于不同元素标记物的荧光免疫层析方法也已经出现，并获得高灵敏度，但是该定量检测方法也存在以下缺陷：⑴实际检测中，阴性结果所占比率很高，但该方法所有试纸条均需要用仪器读取，否则不能得到结果，在做大批量样本检测时，耗时较长；⑵定量检测中，检测部门仍然需要一个阈值来区分阴性和阳性，所以数据处理量较大。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该定性定量免疫层析试纸条灵敏度高、检测时间短、操作简便，并能同时实现定性和定量检测检测样本中黄曲霉毒素B1。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条，在底板上依次搭接设置有滤纸、样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸；玻璃纤维膜上附着有胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，检测线上包被有荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原，质控线上包被有第二抗体。在本专利技术中，荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原为偶联有大分子蛋白和荧光微球的黄曲霉毒素B1。作为优选，大分子蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。作为优选，荧光微球为直径0.01～10μm的稀土离子作为标记物来制备的包裹荧光物质的微球。作为优选，荧光物质为有机或无机的荧光物质，或者为多种荧光物质的掺杂物，或者为量子点。作为优选，胶体金颗粒为直径10～100nm的金颗粒。作为优选，胶体金颗粒是直径为10～100nm的采用柠檬酸三钠还原氯金酸来制备的金颗粒，其表面带有负电荷，可以与蛋白质进行偶联。本专利技术还提供了该定性定量免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：将黄曲霉毒素B1与大分子偶联，得到黄曲霉毒素B1人工抗原，然后采用荧光微球对黄曲霉毒素B1人工抗原进行标记，得到荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原；在硝酸纤维素膜的检测线位置包被荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原，在硝酸纤维素膜的质控线位置包被第二抗体；采用胶体金颗粒对黄曲霉毒素B1单克隆抗体进行标记，得到胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，将胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体附着于玻璃纤维膜上；在底板上依次搭接粘贴滤纸、样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸，得到用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条。作为优选，胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体的喷涂量为1.5～2.5μL/cm。优选地，胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体的喷涂量为2.0μL/cm。在本专利技术中，胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法如下：取胶体金溶液40mL，用0.02M的碳酸钾调节pH为8.0，加入黄曲霉毒素B1单克隆抗体，使其终浓度达到5～50μg/mL，混匀后，室温搅拌反应1～4h，然后加入10％牛血清白蛋白(BSA)，室温反应0.5h～1h，在(2000～5000)×g离心5～15min，沉淀用0.02MpH8.0的磷酸盐缓冲液复溶，复溶液体积为起始体积的十分之一，于4℃保存。在本专利技术提供的具体实施例中，胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法如下：取胶体金溶液40mL，用0.02M的碳酸钾调节pH为8.0，加入200μg的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，混匀后，室温搅拌反应1h，然后加入10％牛血清白蛋白(BSA)，室温反应0.5h，在5000×g离心5～15min，沉淀用0.02MpH8.0的磷酸盐缓冲液复溶，复溶液体积为起始体积的十分之一，于4℃保存。在本专利技术中，将胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体附着于玻璃纤维膜上具体为：将上述复溶液喷涂至玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，喷涂量为2～4μL/cm。作为优选，荧光微球标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条，其特征在于，在底板上依次搭接设置有滤纸、样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维膜上附着有胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原，所述质控线上包被有第二抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测黄曲霉毒素B1的定性定量免疫层析试纸条，其特征在于，在底板上依次搭接设置有滤纸、样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维膜上附着有胶体金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原，所述质控线上包被有第二抗体。2.根据权利要求1所述的定性定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原为偶联有大分子蛋白和荧光微球的黄曲霉毒素B1。3.根据权利要求2所述的定性定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述大分子蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。4.根据权利要求2所述的定性定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球为直径0.01～10μm的稀土离子作为标记物来制备的包裹荧光物质的微球。5.根据权利要求4所述的定性定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光物质为有机或无机的荧光物质，或者为多种荧光物质的掺杂物，或者为量子点。6.根据权利要求1所述的定性定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金颗粒为直径10～100nm的金颗粒。7.如权利要求1至6中任一项所述定性定量免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将黄曲霉毒素B1与大分子偶联，得到黄曲霉毒素B1人工抗原，然后采用荧光微球对黄曲霉毒素B1人工抗原进行标记，得到荧光微球标记的黄曲霉毒素B1人工抗原；在硝酸纤维素膜的检测线位置包被荧光微球...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭丽容，程敏，陈媛，张勇，张凯义，吕茜，
申请(专利权)人：无限极中国有限公司，弘正道中国中药研究有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44