一种大鼠CD4抗体包被磁珠及其制备方法和应用以及含该磁珠的试剂盒技术

本发明专利技术一种大鼠CD4抗体包被磁珠及其制备方法和应用以及含该磁珠的试剂盒。磁珠的制备方法，将磁珠通过不同试剂多次洗涤并去上清液制成。通过上述制备方法可制得的大鼠CD4抗体包被磁珠。所制得的大鼠CD4抗体包被磁珠可以用于试剂盒内用于检测大鼠肾移植后的免疫排斥反应中的应用。较之现有技术而言，本发明专利技术的优点在于：大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法，通过上述方法制成的大鼠CD4抗体包被磁珠结合

A rat CD4 antibody coated magnetic bead, its preparation method and application, and a kit containing the magnetic bead

The invention relates to a rat CD4 antibody coated magnetic bead, a preparation method and application thereof, and a kit containing the magnetic bead. The preparation method of magnetic beads is that magnetic beads are washed repeatedly by different reagents and supernatant is removed. The prepared rat CD4 antibody can be coated with magnetic beads. The prepared CD4 antibody-coated magnetic beads can be used in the kit to detect the immunological rejection after kidney transplantation in rats. Compared with the prior art, the advantages of the present invention are: the preparation method of rat CD4 antibody coated magnetic beads, and the rat CD4 antibody coated magnetic beads prepared by the above method bind to the magnetic beads.

【技术实现步骤摘要】
一种大鼠CD4抗体包被磁珠及其制备方法和应用以及含该磁珠的试剂盒
本专利技术涉及一种大鼠CD4抗体包被磁珠及其制备方法和应用以及含该磁珠的试剂盒。
技术介绍
现有市面上，还没有一种试剂盒，能够用来检测大鼠肾移植后的免疫排斥反应。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大鼠CD4抗体包被磁珠及其制备方法和应用以及含该磁珠的试剂盒。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法，步骤1：将磁珠通过C1试剂洗涤，之后放在磁铁上吸附后去上清液；步骤2：将步骤1预处理的磁珠中加入抗体、C1试剂、C2试剂后，在室温条件下离心旋转16-24h；步骤3：将步骤2处理的磁珠通过磁铁沉淀，后通过HB试剂进行清洗；步骤4：将步骤3处理的磁珠通过磁铁沉淀后去上清，后通过LB试剂进行清洗；步骤5：将步骤4处理的磁珠通过磁铁沉淀后去上清，后通过SB试剂进行清洗；该过程可根据抗体渗漏情况重复多次；步骤6：将步骤5处理的磁珠再加入SB试剂，离心处理，之后放置于磁铁吸附后去除上清液，完成大鼠CD4抗体包被磁珠的制备；其中，C1试剂为60-100％丙烯醛缓冲液，C2试剂为PBS缓冲液。它还包括步骤7：将步骤6处理的磁珠中加入SB试剂，在2-8℃下储存。步骤7中还包括防腐剂叠氮化钠。进一步的，步骤2中，磁珠和抗体、C1试剂、C2试剂的重量体积比为1mg∶20ul∶30ul∶50ul。进一步的，步骤3中，磁珠和HB试剂的重量体积比为1mg∶40ul。进一步的，步骤4中，磁珠和LB试剂的重量体积比为1mg∶40ul。进一步的，步骤5中，磁珠和SB试剂的重量体积比为1mg∶40ul。所述HB试剂、LB试剂、SB试剂均为0.01％-0.1％Tween20。所述磁珠为环氧树脂磁珠。所述抗体为兔抗鼠的抗体。一种通过上述制备方法制得的大鼠CD4抗体包被磁珠。一种试剂盒，所述试剂盒包括大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法所制得的大鼠CD4抗体包被磁珠。大鼠CD4抗体包被磁珠在检测大鼠肾移植后的免疫排斥反应中的应用。较之现有技术而言，本专利技术的优点在于：大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法，通过上述方法制成的大鼠CD4抗体包被磁珠结合ImmuKnowTM-Cylex免疫细胞功能测定试剂盒，能够用于检测大鼠肾移植后的免疫排斥反应。附图说明图1正常大鼠和肾移植大鼠ATP水平测定对比图。具体实施方式下面结合说明书附图和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明：实施例1：一种大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：用适量75％是丙烯醛缓冲液试剂洗环氧树脂磁珠，涡旋。洗完后放在磁铁上吸附1min，然后去上清。该过程中，只要保证丙烯醛缓冲液的量能够清洗环氧树脂磁珠即可，即便过量也无妨。步骤2：将步骤1预处理的环氧树脂磁珠中加入丙烯醛缓冲液、PBS缓冲液后，在37℃室温条件下离心旋转16h；其中各组分的占比如下：5mg环氧树脂磁珠、100ul兔抗鼠抗体、150ul丙烯醛缓冲液、250ulPBS缓冲液。步骤3：将步骤2处理的环氧树脂磁珠通过磁铁沉淀1min，后通过HB试剂进行清洗；5mg的环氧树脂磁珠用200ul0.05％Tween20试剂进行清洗。步骤4：将步骤3处理的环氧树脂磁珠通过磁铁沉淀1min后去上清，后通过LB试剂进行清洗；5mg的环氧树脂磁珠用200ul0.05％Tween20进行清洗。步骤5：将步骤4处理的环氧树脂磁珠通过磁铁沉淀1min后去上清，后通过SB试剂进行清洗；5mg的环氧树脂磁珠用200ul0.05％Tween20试剂进行清洗。步骤6：将步骤5处理的环氧树脂磁珠再加入0.05％Tween20试剂，离心处理，之后放置于磁铁吸附后去除上清液，完成大鼠CD4抗体包被磁珠的制备。步骤7：将步骤6处理的磁珠中加入0.05％Tween20试剂，在2-8℃下储存。其中，按100ulSB试剂/mg磁珠的配比关系，添加0.05％Tween20试剂。实施例2一种试剂盒，所述试剂盒包括实施例1中大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法所制得的大鼠CD4抗体包被磁珠。实施例3对专利技术制得的大鼠CD4抗体包被磁珠进行ATP检测，具体实验过程如下：1.试验第一部分：细胞刺激。预先从冰箱取出试剂盒中相关组分并平衡至室温。1.1小心地颠倒混匀质控对照和大鼠CD4全血样本，重复多次以确保血细胞分布均匀。：1.2用样本稀释液按1:3稀释质控和全血样本(例如：250ul全血+750ul样本稀释液)。1.3稀释后，每个样本使用一条8孔培养板板条，按照工作表组装培养板。1.4将25ul样本稀释液加入每个板条的前4个孔中，作为非刺激孔。1.5将25ul样本稀释液加入每个板条的其余4个孔中，作为刺激孔。1.6将100ul已稀释的质控样本加入板条1的各孔中。1.7根据工作表，将100ul已稀释的待测样本加入相应板条的各孔中。1.8盖上培养板盖，在平板振荡器上震荡30秒。1.9将带盖的培养板在37℃/5％CO2/加湿处理的培养箱中孵育16-18小时。2.实验第2部分：CD4细胞选择和ATP释放。预先从冰箱取出试剂盒中相关组分并平衡至室温。2.1从培养相中拿出培养板，置于平板振荡器上震荡3分钟。2.2小心颠倒CD4磁珠溶液试剂瓶若干次以充分悬浮磁珠；用单通道移液器或连续加样移液器向各孔分别加入50ul磁珠。磁珠在吸取前应充分悬浮以确保各孔加入量一致。注意：因为磁珠不易在储液槽中充分悬浮，请不要用多通道微量移液器操作这一步骤。2.3盖上培养板盖，在平板振荡器上震荡30秒，室温下静置(18-28℃)孵育15分钟。震荡培养板30秒，室温(18-28℃)再次静置孵育15分钟。最后，再次震荡培养板30秒以重新悬浮磁珠。2.4从培养板上取出板条，放在组装好的磁座上，等待1-2分钟使磁珠聚集在孔的一侧；按以下步骤从全血中分离CD4细胞。2.5用连接到负压抽吸真空泵系统的8通道吸头伸入微孔吸除磁珠以外的的含红细胞培养液。注意轻柔操作，避免吸走磁珠。2.6洗涤板条三次，以清除残余的未结合的游离细胞和孔中的其他干扰物质。注意：加入洗涤液时，需垂直提持多通道微量移液器，避免移液器吸头触碰微孔内壁上的磁珠。洗涤#1：向各孔加入200ul洗涤液，等待一分钟，然后吸走洗涤液。洗涤#2：向各孔加入200ul洗涤液，检查微孔内壁，若有凝血斑，则用微量移液器吸头将其移除。等待1分钟，然后吸走洗涤液。洗涤#3：向各孔加入200ul洗涤液，从磁座上移去板条架，将板条放在平板振荡器上振荡1分钟，然后将板条架放在磁座上。等待1分钟，待磁珠聚集在孔的一侧，然后吸走洗涤液。2.7向各孔加入200ul裂解试剂。2.8将板条架从磁座上移开，在平板振荡器上振荡5分钟。2.9将板条架放在磁座上，等待1-2分钟。2.10继续进行试验第3部分。注意：如果不能立即(4小时内)进行试验第3部分，应将板条冷冻保存：将板条从磁座板条架上取下来，放在培养板框架上；密封板条，盖上培养板盖，-20℃冷冻保存。冷冻的板条至少在1个月内保持稳定。若要继续进行后续检测试验，从冰箱中取出培养板，将其平衡至室温(18-28℃)，把板条放入磁座板条架上，然后重复上述2.8和2.9步骤。3.试验第3部分：ATP测量。3.1参照试验工作表组装测量板：测量板包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：步骤1：将磁珠通过C1试剂洗涤，之后放在磁铁上吸附后去上清液；步骤2：将步骤1预处理的磁珠中加入抗体、C1试剂、C2试剂后，在25‑37℃条件下离心旋转16‑24h；步骤3：将步骤2处理的磁珠通过磁铁沉淀，后通过HB试剂进行清洗；步骤4：将步骤3处理的磁珠通过磁铁沉淀后去上清，后通过LB试剂进行清洗；步骤5：将步骤4处理的磁珠通过磁铁沉淀后去上清，后通过SB试剂进行清洗；步骤6：将步骤5处理的磁珠再加入SB试剂，离心处理，之后放置于磁铁吸附后去除上清液，完成大鼠CD4抗体包被磁珠的制备；其中，C1试剂为60‑100％丙烯醛缓冲液，C2试剂为PBS缓冲液；所述HB试剂、LB试剂、SB试剂均为0.01％‑0.1％Tween20。

【技术特征摘要】
1.一种大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：步骤1：将磁珠通过C1试剂洗涤，之后放在磁铁上吸附后去上清液；步骤2：将步骤1预处理的磁珠中加入抗体、C1试剂、C2试剂后，在25-37℃条件下离心旋转16-24h；步骤3：将步骤2处理的磁珠通过磁铁沉淀，后通过HB试剂进行清洗；步骤4：将步骤3处理的磁珠通过磁铁沉淀后去上清，后通过LB试剂进行清洗；步骤5：将步骤4处理的磁珠通过磁铁沉淀后去上清，后通过SB试剂进行清洗；步骤6：将步骤5处理的磁珠再加入SB试剂，离心处理，之后放置于磁铁吸附后去除上清液，完成大鼠CD4抗体包被磁珠的制备；其中，C1试剂为60-100％丙烯醛缓冲液，C2试剂为PBS缓冲液；所述HB试剂、LB试剂、SB试剂均为0.01％-0.1％Tween20。2.根据权利要求1所述的大鼠CD4抗体包被磁珠的制备方法，其特征在于：它还包括步骤7：将步骤6处理的磁珠中加入SB试剂，在2-8℃下储存。3.根据权利要求1所述的大鼠CD4...

【专利技术属性】
技术研发人员：周浩，
申请(专利权)人：福建中医药大学附属人民医院福建省人民医院，
类型：发明
国别省市：福建,35