一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法技术

技术编号:20094087 阅读:29 留言:0更新日期:2019-01-15 12:50
本发明专利技术公开了一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,本发明专利技术通过大量实验筛选,首先取样品采用优选的酶进行酶解,然后进行脱盐处理,然后采用最佳的Nano LC‑MS/MS方法进行高通量鉴定肽段序列,比对不同样品不同物种间同源蛋白序列差异验证专属性肽段,最后采用优选的LC‑QQQ MS分析验证正品中专属性肽段的专属性。整个方法科学性强,操作方便,可用于鉴别中药动物药、食品、水产品的正品和伪品,具有重要的应用价值。

A Method for Identification of Specific Peptide Fragments of Protein-Containing Traditional Chinese Medicine

The invention discloses a method for identifying specific peptide segments of protein-containing traditional Chinese medicines. Through a large number of experimental screening, the sample is first enzymatically hydrolyzed by optimized enzymes, then desalinated, and then high-throughput identification of peptide segments by using the best Nano LC MS/MS method. The specific peptide segments are validated by comparing the differences of homologous protein sequences among different species of different samples. Finally, LC QQ MS analysis was used to verify the specificity of the specific peptide segment in the authentic product. The whole method is scientific and easy to operate. It can be used to identify the authentic and counterfeit products of traditional Chinese medicine, animal medicine, food and aquatic products, and has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法
本专利技术涉及中药、食品、水产品等及其加工产品领域,尤其涉及到中药材、深加工食品、海产品等的真伪鉴别。
技术介绍
中药动物药我国医药宝库的重要组成部分,是中药三大来源之一,其传统研究思路以中医理论为指导,重点研究临床应用等相关方面,主要包括:本草考证、资源调查、基源鉴定、动物药化学、加工炮制、药效研究、品质评价等。动物药作为动物的器官、组织或代谢产物,其来源、组成、成分与植物药大相径庭,动物药研究是中药研究领域特有的分支,是具有独特体系的学科,因此采用目前相对较成熟的植物药研究思路去探索动物药的道路是很难走通的。其中动物药的专属性鉴定方法研究起步较晚,目前主要的鉴定方法包括显微鉴别、薄层鉴别、氨基酸鉴别、DNA条形码鉴别、特征肽段鉴别等。其中DNA条形码鉴别、特征肽段鉴别为近年发展起来的新兴鉴定方法。对于特征性肽段鉴定的方法,关键是如何寻找确定专属性肽段,目前主要的方法是高通量质谱、生物信息学与多元统计分析相结合来寻找专属性肽段,然而基于多元统计学分析的方法可能由于小概率分析结果,依然可能出现假阳性的结果,寻找得到的肽段并非专属性肽段,或由于样本量不够大,而找不出专属性肽段。为此,本专利技术在高通量质谱的基础上,规避统计学的分析方法,而采用数学集合的方法来寻找专属性肽段,构建正品的肽段集合与伪品的肽段集合,通过两者相交,取完全属于正品集合,同时完全不属于伪品集合的肽段作为专属性肽段的候选肽段,即回避概率性的分析,而采用“全”或“无”的分析思路寻找专属性肽段。
技术实现思路
专利技术目的:本专利技术的目的是通过高通量质谱与数学集合的比较方法相结合,提供一种可快速、正确的从中药动物药、食品、水产品等样品中快速寻找到可用于鉴定样品的专属性肽段的方法。技术方案:为了实现以上目的,本专利技术采取的技术方案为:一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,包括以下步骤:(1)样品酶解取含蛋白质类中药采用酶进行酶解,得酶解液;(2)酶解液脱盐取酶解液,进行脱盐处理;(3)采用NanoLC-MS/MS高通量鉴定肽段序列;(4)根据数学集合理论寻找专属性肽段取所有批次正品中鉴定得到的肽段序列的交集,为集合A,取所有批次伪品中鉴定得到的肽段序列的并集,为集合B;将集合A与集合B相交,集合A中不属于集合B的肽段序列作为专属性肽段;(5)通过比对不同样品不同物种间同源蛋白序列差异验证专属性肽段的可靠性与准确性;(6)通过LC-QQQMS分析验证正品中专属性肽段的专属性。作为优选方案,以上所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,步骤(1)样品酶解的方法为:取样品粉末,加入Tris缓冲液,超声提取,待样品溶解后,离心,然后加入胰蛋白酶、LysC或GluC,酶解过夜;或者为:取样品粉末,加入含4%SDS的Tris缓冲液溶解,超声提取,离心,加入丙酮沉淀,离心,弃去上清,用丙酮洗涤,离心,将丙酮挥干,加入含有尿素的Tris缓冲液溶解,加入胰蛋白酶、LysC或GluC,酶解过夜;或者为:取样品粉末,加入含有尿素的Tris缓冲液溶解,超声提取,离心,取上清液再用Tris缓冲液将溶液中尿素浓度稀释至1M以下,加入胰蛋白酶、LysC或GluC,酶解过夜。作为优选方案,以上所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(2)酶解液脱盐方法为:SeppakC18脱盐:按如下顺序处理:用乙腈活化SeppakC18柱三次,再用三氟乙酸溶液平衡3次,然后将步骤(1)的酶解液上SeppakC18柱,用三氟乙酸冲洗,再用含0.2%三氟乙酸的80%乙腈溶液洗脱,收集洗脱液,离心浓缩干燥,保存。或者为:OMIXC18脱盐:按如下顺序处理:取乙腈活化固相萃取头OMIXC18吸头,然后用三氟乙酸溶液平衡,然后将步骤(1)的酶解液上固相萃取头OMIXC18,用吸头在样品溶液中反复吹吸,再用0.1%三氟乙酸冲洗,吸取含0.2%三氟乙酸的80%乙腈溶液于另一EP管中反复吹吸,收集洗脱液,离心浓缩干燥,保存。作为优选方案,以上所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(3)所述的NanoLC-MS/MS高通量鉴定肽段序列的方法为:取步骤(2)脱盐后的样品用流动相复溶后,注入戴安U3000NanoRSLC纳升液相系统,色谱柱为5μmReprosilC18AQ(75μm×150mm),上样量为1~2μL,流速200~400nL/min,流动相A(乙腈/甲酸/水=2/0.2/98,v/v/v),流动相B(乙腈/甲酸/水=80/0.2/20,v/v/v),2~30%B线性梯度洗脱150min;并用ThermoLTQOrbitrapXL质谱仪用于进行肽段分析,喷雾电压为2.5kV,离子传输毛细管温度为200℃;质谱一级全扫描范围为m/z300~2000,分离宽度为3Da;串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式,依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱,并采用Xcalibur软件进行数据采集;二级质谱数据采用PEAKS8.5软件进行搜库鉴定分析,选择对应的蛋白质数据库,检索参数设置为:前体离子误差10ppm;子离子误差1Da;允许2个位点误切,假阳性率≤1%;酶切方式选择胰酶(Trypsin、LysC或GluC),唯一肽段数≥2;其它参数为默认参数,在上述检索条件下所得分值有显著性意义,P<0.05被认定为有效的鉴定结果;鉴定确定每个样品酶解液中所有肽段的氨基酸序列。作为优选方案,以上所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(4)根据数学集合理论寻找专属性肽段方法为:取所有批次正品中鉴定得到的肽段序列的交集,为集合A,取所有批次伪品中鉴定得到的肽段序列的并集,为集合B;将集合A与集合B相交,集合A中不属于集合B的肽段序列作为专属性肽段。作为优选方案,以上所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(5)采用MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis软件比对不同物种的同源蛋白之间序列差异,确定鉴定得到的肽段在不同种属间的专属性。作为优选方案,以上所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(6)采用LC-QQQMS验证肽段的专属性的方法为:采用液相色谱-串连质谱法,以C18色谱柱为色谱柱,流动相由流动相A和流动相B组成,流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱为:0-5min,5%流动相B,5-15min,5-50%的流动相B,质谱为正离子检测模式,雾化器温度为350℃,雾化器流速为10L/min,雾化器压力为35psi,毛细管电压为3500V,鞘流气温度为350℃,鞘流气流速为12L/min,毛细管电压为4500V,和锥孔电压为500V;采用质谱多反应监测挑选目标肽段的母离子与自离子,以正品与伪品中是否存在母离子→子离子的离子对来验证肽段的专属性。作为优选方案,以上所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,蛋白质类中药包括阿胶、明胶、黄明胶、鹿皮胶、龟甲胶、羚羊角、水牛角、牦牛角、山羊角、穿山甲、猪蹄甲、水蛭、白花蛇、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)样品酶解取含蛋白质类中药采用酶进行酶解,得酶解液;(2)酶解液脱盐取酶解液,进行脱盐处理;(3)采用Nano LC‑MS/MS高通量鉴定肽段序列;(4)根据数学集合理论寻找专属性肽段取所有批次正品中鉴定得到的肽段序列的交集,为集合A,取所有批次伪品中鉴定得到的肽段序列的并集,为集合B;将集合A与集合B相交,集合A中不属于集合B的肽段序列作为专属性肽段;(5)通过比对不同样品不同物种间同源蛋白序列差异验证专属性肽段的可靠性与准确性。

【技术特征摘要】
1.一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)样品酶解取含蛋白质类中药采用酶进行酶解,得酶解液;(2)酶解液脱盐取酶解液,进行脱盐处理;(3)采用NanoLC-MS/MS高通量鉴定肽段序列;(4)根据数学集合理论寻找专属性肽段取所有批次正品中鉴定得到的肽段序列的交集,为集合A,取所有批次伪品中鉴定得到的肽段序列的并集,为集合B;将集合A与集合B相交,集合A中不属于集合B的肽段序列作为专属性肽段;(5)通过比对不同样品不同物种间同源蛋白序列差异验证专属性肽段的可靠性与准确性。2.根据权利要求1所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(5)之后再增加步骤(6)通过LC-QQQMS分析验证正品中专属性肽段的专属性。3.根据权利要求1所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(1)样品酶解的方法为:取样品粉末,加入Tris缓冲液,超声提取,待样品溶解后,离心,然后加入胰蛋白酶、LysC或GluC,酶解过夜;或者为:取样品粉末,加入含4%SDS的Tris缓冲液溶解,超声提取,离心,加入丙酮沉淀,离心,弃去上清,用丙酮洗涤,离心,将丙酮挥干,加入含有尿素的Tris缓冲液溶解,加入胰蛋白酶、LysC或GluC,酶解过夜;或者为:取样品粉末,加入含有尿素的Tris缓冲液溶解,超声提取,离心,取上清液再用Tris缓冲液将溶液中尿素浓度稀释至1M以下,加入胰蛋白酶(Trypsin)、LysC或GluC,酶解过夜。4.根据权利要求1所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(2)酶解液脱盐方法为:SeppakC18脱盐:按如下顺序处理:用乙腈活化SeppakC18柱三次,再用三氟乙酸溶液平衡3次,然后将步骤(1)的酶解液上SeppakC18柱,用三氟乙酸冲洗,再用含0.2%三氟乙酸的80%乙腈溶液洗脱,收集洗脱液,离心浓缩干燥,保存。或者为:OMIXC18脱盐:按如下顺序处理:取乙腈活化固相萃取头OMIXC18吸头,然后用三氟乙酸溶液平衡,然后将步骤(1)的酶解液上固相萃取头OMIXC18,用吸头在样品溶液中反复吹吸,再用0.1%三氟乙酸冲洗,吸取含0.2%三氟乙酸的80%乙腈溶液于另一EP管中反复吹吸,收集洗脱液,离心浓缩干燥,保存。5.根据权利要求1所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(3)所述的NanoLC-MS/MS高通量鉴定肽段序列的方法为:取步骤(2)脱盐后的样品用流动相复溶后,注入戴安U3000NanoRSLC纳升液相系统,色谱柱为5μmReprosilC18AQ(75μm×150mm),上样量为1~2μL,流速200~400nL/min,流动相A(乙腈/甲酸/水=...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘睿段金廒郑云枫
申请(专利权)人:南京中医药大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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