The invention discloses a method for identifying specific peptide segments of protein-containing traditional Chinese medicines. Through a large number of experimental screening, the sample is first enzymatically hydrolyzed by optimized enzymes, then desalinated, and then high-throughput identification of peptide segments by using the best Nano LC MS/MS method. The specific peptide segments are validated by comparing the differences of homologous protein sequences among different species of different samples. Finally, LC QQ MS analysis was used to verify the specificity of the specific peptide segment in the authentic product. The whole method is scientific and easy to operate. It can be used to identify the authentic and counterfeit products of traditional Chinese medicine, animal medicine, food and aquatic products, and has important application value.
【技术实现步骤摘要】
一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法
本专利技术涉及中药、食品、水产品等及其加工产品领域,尤其涉及到中药材、深加工食品、海产品等的真伪鉴别。
技术介绍
中药动物药我国医药宝库的重要组成部分,是中药三大来源之一,其传统研究思路以中医理论为指导,重点研究临床应用等相关方面,主要包括:本草考证、资源调查、基源鉴定、动物药化学、加工炮制、药效研究、品质评价等。动物药作为动物的器官、组织或代谢产物,其来源、组成、成分与植物药大相径庭,动物药研究是中药研究领域特有的分支,是具有独特体系的学科,因此采用目前相对较成熟的植物药研究思路去探索动物药的道路是很难走通的。其中动物药的专属性鉴定方法研究起步较晚,目前主要的鉴定方法包括显微鉴别、薄层鉴别、氨基酸鉴别、DNA条形码鉴别、特征肽段鉴别等。其中DNA条形码鉴别、特征肽段鉴别为近年发展起来的新兴鉴定方法。对于特征性肽段鉴定的方法,关键是如何寻找确定专属性肽段,目前主要的方法是高通量质谱、生物信息学与多元统计分析相结合来寻找专属性肽段,然而基于多元统计学分析的方法可能由于小概率分析结果,依然可能出现假阳性的结果,寻找得到的肽段并非专属性肽段,或由于样本量不够大,而找不出专属性肽段。为此,本专利技术在高通量质谱的基础上,规避统计学的分析方法,而采用数学集合的方法来寻找专属性肽段,构建正品的肽段集合与伪品的肽段集合,通过两者相交,取完全属于正品集合,同时完全不属于伪品集合的肽段作为专属性肽段的候选肽段,即回避概率性的分析,而采用“全”或“无”的分析思路寻找专属性肽段。
技术实现思路
专利技术目的:本专利技术的目的是通过高通量质谱 ...
【技术保护点】
1.一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)样品酶解取含蛋白质类中药采用酶进行酶解,得酶解液;(2)酶解液脱盐取酶解液,进行脱盐处理;(3)采用Nano LC‑MS/MS高通量鉴定肽段序列;(4)根据数学集合理论寻找专属性肽段取所有批次正品中鉴定得到的肽段序列的交集,为集合A,取所有批次伪品中鉴定得到的肽段序列的并集,为集合B;将集合A与集合B相交,集合A中不属于集合B的肽段序列作为专属性肽段;(5)通过比对不同样品不同物种间同源蛋白序列差异验证专属性肽段的可靠性与准确性。
【技术特征摘要】
1.一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)样品酶解取含蛋白质类中药采用酶进行酶解,得酶解液;(2)酶解液脱盐取酶解液,进行脱盐处理;(3)采用NanoLC-MS/MS高通量鉴定肽段序列;(4)根据数学集合理论寻找专属性肽段取所有批次正品中鉴定得到的肽段序列的交集,为集合A,取所有批次伪品中鉴定得到的肽段序列的并集,为集合B;将集合A与集合B相交,集合A中不属于集合B的肽段序列作为专属性肽段;(5)通过比对不同样品不同物种间同源蛋白序列差异验证专属性肽段的可靠性与准确性。2.根据权利要求1所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(5)之后再增加步骤(6)通过LC-QQQMS分析验证正品中专属性肽段的专属性。3.根据权利要求1所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(1)样品酶解的方法为:取样品粉末,加入Tris缓冲液,超声提取,待样品溶解后,离心,然后加入胰蛋白酶、LysC或GluC,酶解过夜;或者为:取样品粉末,加入含4%SDS的Tris缓冲液溶解,超声提取,离心,加入丙酮沉淀,离心,弃去上清,用丙酮洗涤,离心,将丙酮挥干,加入含有尿素的Tris缓冲液溶解,加入胰蛋白酶、LysC或GluC,酶解过夜;或者为:取样品粉末,加入含有尿素的Tris缓冲液溶解,超声提取,离心,取上清液再用Tris缓冲液将溶液中尿素浓度稀释至1M以下,加入胰蛋白酶(Trypsin)、LysC或GluC,酶解过夜。4.根据权利要求1所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(2)酶解液脱盐方法为:SeppakC18脱盐:按如下顺序处理:用乙腈活化SeppakC18柱三次,再用三氟乙酸溶液平衡3次,然后将步骤(1)的酶解液上SeppakC18柱,用三氟乙酸冲洗,再用含0.2%三氟乙酸的80%乙腈溶液洗脱,收集洗脱液,离心浓缩干燥,保存。或者为:OMIXC18脱盐:按如下顺序处理:取乙腈活化固相萃取头OMIXC18吸头,然后用三氟乙酸溶液平衡,然后将步骤(1)的酶解液上固相萃取头OMIXC18,用吸头在样品溶液中反复吹吸,再用0.1%三氟乙酸冲洗,吸取含0.2%三氟乙酸的80%乙腈溶液于另一EP管中反复吹吸,收集洗脱液,离心浓缩干燥,保存。5.根据权利要求1所述的一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法,其特征在于,步骤(3)所述的NanoLC-MS/MS高通量鉴定肽段序列的方法为:取步骤(2)脱盐后的样品用流动相复溶后,注入戴安U3000NanoRSLC纳升液相系统,色谱柱为5μmReprosilC18AQ(75μm×150mm),上样量为1~2μL,流速200~400nL/min,流动相A(乙腈/甲酸/水=...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘睿,段金廒,郑云枫,
申请(专利权)人:南京中医药大学,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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