精浆脱氧胞苷和胞苷检测作为特发性男性不育诊断标志物及其应用制造技术

本发明专利技术属于分析化学及临床医学领域，公开了精浆脱氧胞苷和胞苷检测作为特发性男性不育诊断标志物及其应用。该标志物为脱氧胞苷和/或胞苷，在诊断特发性男性不育中具有较高灵敏度和特异度，可用于制备特发性男性不育诊断或监测试剂。

Detection of seminal deoxycytidine and cytidine as diagnostic markers of idiopathic male infertility and its application

The invention belongs to the field of analytical chemistry and clinical medicine, and discloses the detection of seminal plasma deoxycytidine and cytidine as diagnostic markers of idiopathic male infertility and its application. The markers are deoxycytidine and/or cytidine, which have high sensitivity and specificity in the diagnosis of idiopathic male infertility and can be used to prepare diagnostic or monitoring reagents for idiopathic male infertility.

【技术实现步骤摘要】
精浆脱氧胞苷和胞苷检测作为特发性男性不育诊断标志物及其应用专利
本专利技术属于分析化学及临床医学领域，涉及基于UPLC-QexactiveMS检测精浆中与特发性男性不育相关的脱氧胞苷和胞苷及其应用。
技术介绍
1988年，WHO首次提出了生殖健康的概念，即人类及其个体在整个生命过程中与生殖相关的机体的结构、功能和行为过程中的生理、心理和社会的完满和谐的健康状态。目前，全球约有10-15％的育龄夫妇患有生育障碍。我国由于人口基数大，新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万，其中男性因素导致的不育高于50％。目前的研究认为遗传因素如Y染色体AZF基因区域序列改变、DAZ基因拷贝数改变、性激素受体基因序列改变等。环境因素如有害因素暴露、营养和生活习惯等均与男性不育有关。值得注意的是，男性不育有相当一部分表现为无法解释病因，这使得诊断特发性男性不育变得极为困难，也贻误了治疗时机。男性不育的WHO的诊断标准是夫妻婚后同居1年以上，未采取避孕措施，由于男方原因造成女方不孕者。然而，同居长达1年的观察时间，大大耽误了对男性不育进行早期治疗和干预的时间；很多夫妻并不能保证严格的同居1年，使得最后的男性不育判断变得非常困难；为了排除女方原因，女方还需要进行详细的检查，带来了沉重的经济和医疗负担。现有的男性不育相关检查依赖的是传统的精液常规检查，它只关注精子数量、活力、精液量、pH和液化时间等常规参数。因为受到禁欲时间等因素的影响，常规精液参数常规分析结果表现为较大的波动性。因而，临床诊断往往需要参考多次精液常规分析。更为重要的是，传统的精液参数检查不能全面地反映精液的全部状况。因此，男性不育经常表现为常规精液参数无明显异常，也使得传统的精液参数检查并不能有效诊断男性不育。因而，临床上亟需用于特发性男性不育的新的诊断方法。代谢组学(metabonomics)是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后系统生物学的新的另一重要研究领域，它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学，所关注的是代谢循环中分子量小于1000的小分子代谢物的变化，反映的是机体在疾病状态或环境刺激下的应答变化。代谢组学在复杂疾病的诊断中表现出极高的应用潜力和价值，由于其分析的样本可以为血液尿液各种体液这些无创和低创的样本，可大大提高病人的依从性，且具有灵敏度高稳定的特点。男性不育的根本原因是精液的问题。精浆作为精液的液体成分可以很好地反映精液的质量改变，而且具有无创，容易采集的优点。然而，采用代谢组学分析精浆代谢小分子在特发性男性不育的诊断监测中的应用还未得到相应的关注。目前代谢组学研究常用技术包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)及核磁共振技术(NMR)。核磁共振技术特点是对待测组分无破坏，样本前处理简单，但灵敏度较低；气相色谱-质谱联用具有较好的灵敏度和重现性，但一般要采用衍生化方法对样本进行前处理，使得实验步骤变得复杂。而LC-MS具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点。UPLC-QexactiveMS是新一代高分辨质谱与超高效液相的组合，具有相比传统LC-MS更强的灵敏度、特异度和稳定性。故而采用UPLC-QexactiveMSS进行精浆代谢小分子的代谢组学分析，若能发现稳定的与特发性男性不育发病相关的特异精浆代谢小分子作为生物标志物，并研发相应的代谢小分子标志的UPLC-QexactiveMS检测方法，将为男性生殖健康做出巨大贡献。
技术实现思路
本专利技术的目的是为特发性男性不育提供相关的脱氧胞苷和胞苷。本专利技术另一个目的是为将精浆脱氧胞苷和胞苷用于特发性男性不育诊断提供基于UPLC-QexactiveMS的应用。本专利技术再有一个目的是为上述精浆脱氧胞苷和胞苷提供色谱质谱用检测和诊断试剂盒。本专利技术的目的是通过下列技术措施实现的：特发性男性不育相关的精浆标志物，该标志物为脱氧胞苷和/或胞苷。所述的精浆标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂中的应用。一种诊断或监测特发性男性不育的试剂盒，该试剂盒含有检测精浆中脱氧胞苷和/或胞苷的试剂。所述的试剂盒，该试剂盒含有采用UPLC-QexactiveMS方法检测精浆中脱氧胞苷和/或胞苷的试剂。所述的试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：脱氧胞苷和/或胞苷标准品；内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸中一种或多种物质的同位素内标；内标B：十五烷酸的同位素内标；内标C：二十四烷酸的同位素内标。所述的试剂盒，该试剂盒还含有：HypersilGOLDC18色谱柱；试剂A：沉淀蛋白用，含100％甲醇；试剂B：流动相用，含0.1％的甲酸的水；试剂C：流动相用，含0.1％的甲酸的乙腈；试剂D：复溶用，超纯水。一种检测上述的与特发性男性不育相关的精浆生物标志物的方法，该方法采用UPLC-QexactiveMS方法，检测精浆中脱氧胞苷和/或胞苷含量。所述的方法，该方法中：一、液相条件：液相色谱柱为HypersilGOLDC18色谱柱，柱温为40℃；流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈，流速为400μL/min；仪器梯度为：0-3min1％B，3-10min1％到99％B，10-13min99％B，13-13.1min99％到1％B，13.1-17min1％B；进样方式：体积5μl；二、质谱条件采用加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V；采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000。本专利技术详细描述如下：本专利技术人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的精浆样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC-QexactiveMS的代谢组学方法进行分析。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：一、研究对象选择和分组依据第一阶段筛选阶段随机纳入明确诊断的特发性男性不育148人和健康对照148人，共296人。A组：健康对照组(148人)：1.年龄在19至39岁之间；2.体质指数在17至31之间；3.生殖能力健康的男性，而且5-8个月后有了健康的后代；4.无全身重大疾病。B组：特发性男性不育疾病组(148人)：1.年龄与对照组匹配；2.体质指数与对照组匹配3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；。4.无明确男性不育病因；5.吸烟饮酒史与对照组匹配；6.民族与对照组匹配；7.无全身重大疾病。第二阶段验证阶段纳入明确诊断的特发性男性不育15人和健康对照15人，共30人。A组：健康对照组(15人)：1.年龄在24到36岁之间；2.体质指数在19至24之间；3.生殖能力健康的男性，而且5-8个月后有了健康的后代；4.无全身重大疾病。B组：特发性男性不育疾病组(15人)：1.年龄与对照组匹配；2.体质指数与对照组匹配；3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；4.无明确男性不育本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特发性男性不育相关的精浆标志物，其特征在于该标志物为脱氧胞苷和/或胞苷。

【技术特征摘要】
1.特发性男性不育相关的精浆标志物，其特征在于该标志物为脱氧胞苷和/或胞苷。2.权利要求1所述的精浆标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂中的应用。3.一种诊断或监测特发性男性不育的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有检测精浆中脱氧胞苷和/或胞苷的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有采用UPLC-QexactiveMS方法检测精浆中脱氧胞苷和/或胞苷的试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有下列试剂：脱氧胞苷和/或胞苷标准品；内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸中一种或多种物质的同位素内标；内标B：十五烷酸的同位素内标；内标C：二十四烷酸的同位素内标。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有：HypersilGOLDC18色谱柱；试剂A：沉淀蛋白用，含100％甲醇；试剂B：流动相用，含0.1％的甲酸的水；试剂C：流动相用，含0.1％的甲酸的乙腈；试剂D：复溶用，超...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏健，丁兴旺，庄婷钰，管昱盛，徐菠，周昆，胡艳辉，冒志磊，霍薇薇，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32