一种测定参芪扶正注射液中核苷类含量的方法技术

本发明专利技术提供一种测定参芪扶正注射液中核苷类含量的方法，具体步骤包括：A、调节高效液相色谱仪检测条件：色谱柱：PurospherR STAR C18或Phenomenex Luna C18，流动相：磷酸二氢钾的缓冲水溶液(A)一乙腈(B)；B、样品配制：C、进样、等待供试品及对照品结果，按外标法以峰面积计算，分别计算各供试品各核苷类组分的含量。经过长期反复验证后，本方法准确度、精密度、专属性高，色谱条件耐用性良好。

A Method for the Determination of Nucleosides in Shenqi Fuzheng Injection

The invention provides a method for determining the content of nucleosides in Shenqi Fuzheng Injection. The specific steps include: A. Adjusting the detection conditions of high performance liquid chromatography: chromatographic column: PurospherR STAR C18 or Phenomenex Luna C18, mobile phase: buffer solution of potassium dihydrogen phosphate (A) acetonitrile (B); B. Sample preparation: C, injection, waiting for the results of test products and reference products, according to external standard method. The content of nucleosides in each sample was calculated by peak area calculation. After long-term repeated validation, the method has high accuracy, precision, specificity and good durability in chromatographic conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种测定参芪扶正注射液中核苷类含量的方法
本专利技术属中药的含量测定方法领域，特别涉及参芪扶正注射液的核苷类物质含量的测定方法。
技术介绍
参芪扶正注射液是丽珠集团利民制药厂研制开发成功的国家二类中药新药参芪扶正注射液，该药为国内首创的纯中药澄明大输液，1999年11月获国家药品监督管理局正式生产批文。参芪扶正注射是由传统补气药党参、黄芪组成的复方制剂，具有益气扶正之功效，用于肺脾气虚引起的神疲乏力，少气懒言，自汗眩晕；肺癌、胃癌见上述症候者的辅助治疗。建立数字化中药技术是中药领域一项重大技术突破。参芪扶正注射液成分复杂，非常有必要利用现代先进的分析仪器，明确其中各种物质的含量。CN200710136382.0中报道了有关参芪扶正注射液的质量控制方法，按照该专利公开中记载的方法，建立起了参芪扶正注射液的HPLC指纹图谱，该专利可检测参芪扶正注射液中的多种物质。ZL201210436493.4公开的检测方法中显示，参芪扶正注射液其指纹图谱中仅特征峰就有18个之多；ZL201310008395.5进一步，参芪扶正注射液鉴别出来的成分有毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，异微凸剑叶莎醇-7，2′-二-O-葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素-7-葡萄糖苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-木糖葡萄糖苷、黄芪甲苷、5-羟甲基糠醛等。在当前技术背景中，测定参芪扶正注射液中核苷含量的必要性和意义：参芪扶正注射液是由等比例党参、黄芪药材经水提、醇沉等多道工序精制得到参芪提取物，再以其为原料进行配制、过滤、灭菌等复杂工序而制备的澄清中药大输液。尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷是党参和黄芪药材共有的物质基础，且均易溶于水，因此核苷类成分也是参芪扶正注射液的重要物质基础。由于核苷类成分是生物细胞维持生命的重要物质，具有调节免疫功能、调节血糖、促进肠道修复、降低血压、抗心律市场、抗缺血性损伤等多种生物活性，因此，核苷类含量水平的高低可能会影响参芪扶正注射液的疗效和质量，建立参芪扶正注射液中核苷类的定量分析方法可在一定程度上反映产品的质量。
技术实现思路
本专利技术建立一种利用色谱柱测定参苠扶正注射液中核苷类含量的方法。经过长期反复验证后，本方法准确度、精密度、专属性高，色谱条件耐用性良好。本方法具体步骤如下：1、调节高效液相色谱仪检测条件色谱柱：PurospherRSTARC18(4.6mm×250mm，5μm)流动相：磷酸二氢钾的缓冲水溶液(A)-乙腈(B)流动相梯度见下表1：表1梯度表2、样品配制稀释剂：流动相对照品溶液：精密称取尿苷、腺嘌呤、鸟苷及腺苷适量于量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(浓度分别为约10mg/ml，5mg/ml，5mg/ml，5mg/ml)。供试品溶液：取本品直接过滤即得。3、进样、等待供试品及对照品结果，按外标法以峰面积计算，分别计算各供试品各核苷类组分的含量。计算公式如下：各组分含量＝(供试品峰面积×对照品称样量×对照品含量)/(对照品峰面积×稀释倍数)优选的，上述步骤1)中，流动相A磷酸二氢钾的缓冲水溶液pH为4.5-5.5。pH高于5.5，超出磷酸二氢钾的缓冲能力，低于4.5，容易引起色谱峰的拖尾。优选地，pH为4.6。上述步骤1)中，流动相流速为0.9ml/min-1.1ml/min。当流速低于0.9ml/min，分析用时将增加，效率下降；流速高于1.1ml/min，出峰时间将缩短，但系统压力加大，容易堵塞系统，不适合于缓冲盐系统。优选地，流速为1.0ml/min。上述步骤1)中，色谱柱柱温一般控制在25-35℃。色谱柱温度低于25℃，分离性能下降，出峰时间延长，且控温系统容易产生冷凝水；温度高于35℃，鸟苷含量较30℃下降超过10％，原因尚不明确。优选地，柱温为30℃。上述步骤1)中，高效液相色谱仪的波长选择范围为250-275nm；在该波长范围内，目标组分均有较高的响应，为了和已有指纹图谱标准对应，优选地，波长：266nm。在方法摸索的过程中，分别对色谱柱、检测波长、流动相组成、缓冲盐的浓度等进行考察。色谱柱的筛选：采用了多种色谱柱进行了比对，如UltimateXB-C18、WelchC18色谱柱、PurospherSTARRP-18、PhenomenexLunaC18色谱柱。WelchC18色谱柱按照上述方法进行检测，其检测结果如附图4所示。从图中可以看出，腺嘌呤和鸟苷未能够实现很好的分离，而PurospherSTARRP-18、PhenomenexLunaC18色谱柱都能够实现较好的分离且色谱峰峰型良好，最优地，选择PurospherSTARC18色谱柱。在流动相方面，本专利技术实践了多种流动相，最终选择了采用磷酸二氢钠缓冲液-乙腈作为流动相。例如，以水和乙腈为流动相，其色谱图如附图5。从图中可以看出，尿苷峰拖尾，腺嘌呤和鸟苷未能够实现很好的分离，因此对流动相做了进一步的优化。采用磷酸二氢钠缓冲液-乙腈为流动相，进而继续分别考察了不同浓度磷酸二氢钠缓冲液-乙腈体系，如30mM、40mM、50mM-乙腈所得色谱图如附图6、7、8。从图中可以看出：由于高浓度流动相容易造成色谱管路尤其是色谱柱的堵塞，造成不可逆的伤害，因此选用了30mM磷酸二氢钾-乙腈为流动相进行分离洗脱。附图说明图1混合对照品色谱图；图2171233批成品分析图谱；图3171235批成品分析图谱；图4Welch色谱柱图谱；图5以水和乙腈为流动相所得色谱图；图6磷酸二氢钠浓度为：30mM-乙腈色谱图；图7磷酸二氢钠浓度为：40mM-乙腈色谱图；图8磷酸二氢钠浓度为：50mM-乙腈色谱图；图9线性溶液液相图谱；图10尿苷标准曲线；图11腺嘌呤标准曲线；图12鸟苷标准曲线；图13胸苷标准曲线。具体实施例1.仪器设备、试剂、样品和色谱柱1.1仪器设备(见表2)表2仪器设备1.2试剂及耗材(见表3)表3试剂1.3供试品及对照品(见表4)表4样品信息1.4色谱柱(见表5)表5色谱柱信息2.色谱条件2.1色谱信息：色谱柱：PurospherRSTARC18(4.6mm×250mm，5μm)流动相(梯度表见表6)：磷酸二氢钾的缓冲水溶液(磷酸二氢钾的浓度为30mM，pH约4.60，A)-乙腈(B)表6梯度表：时间(min)A％B％098289822088123040604540604698258982流速：1.0ml/min柱温：30℃波长：266nm进样量：20μl运行时间：58min2.2样品的配制稀释剂：注射用水。对照品溶液的配制：尿苷对照品贮备液：准确称取对照品16.7(7.8)mg，置50(100)ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。腺嘌呤对照品贮备液：准确称取对照品16.6(10.8)mg，置100(100)ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。鸟苷对照品贮备液：准确称取对照品16.8(10.5)mg，置100(100)ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。腺苷对照品贮备液：准确称取对照品17.7(10.6)mg，置100(100)ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。备注：括号内为对照品2的配制；混合对照品贮备液1(RS1)/2/3：分别移取上述核苷类对照品贮备液各3ml于100ml/50ml/2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定参芪扶正注射液中核苷类含量的方法，步骤包括：A、调节高效液相色谱仪检测条件：色谱柱：PurospherR STAR C18或Phenomenex Luna C18，流动相：磷酸二氢钾的缓冲水溶液(A)‑乙腈(B)；B、样品配制；C、进样、等待供试品及对照品结果，按外标法以峰面积计算，分别计算各供试品各核苷类组分的含量。

【技术特征摘要】
1.一种测定参芪扶正注射液中核苷类含量的方法，步骤包括：A、调节高效液相色谱仪检测条件：色谱柱：PurospherRSTARC18或PhenomenexLunaC18，流动相：磷酸二氢钾的缓冲水溶液(A)-乙腈(B)；B、样品配制；C、进样、等待供试品及对照品结果，按外标法以峰面积计算，分别计算各供试品各核苷类组分的含量。2.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤A中，流动相A相磷酸二氢钾的缓冲水溶液pH值为4.5-5.5。3.根据权利要求2所述的方法，所述的步骤A中，流动相A相磷酸二氢钾的缓冲水溶液pH值为4.6。4.据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧志煌，刘学华，汪冰冰，李波，江晓漫，
申请(专利权)人：丽珠集团利民制药厂，
类型：发明
国别省市：广东,44