一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、重复性和适用性高的PCV2病毒样颗粒检测方法，该方法包括如下步骤：步骤S1，稀释待测样品并进行过滤澄清或离心澄清；步骤S2，取蛋白含量已被确定的猪圆环病毒2型病毒样颗粒标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行HPLC检测，建立以浓度为横坐标、峰高为纵坐标的回归方程；步骤S3，对稀释后的待测样品进行HPLC检测得到对应的样品峰高；步骤S4，根据回归方程及样品峰高计算得到待测样品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒浓度，其中，步骤S2及步骤S3中的HPLC所采用的色谱柱为凝胶色谱柱，采用的检测器为紫外检测器，其检测波长为280nm。

A Quantitative Method for Detecting Porcine Circovirus 2 Virus-like Particles*

The aim of the invention is to provide a PCV2 virus like particle detection method with simple operation, high sensitivity, high repeatability and high applicability. The method comprises the following steps: step S1, diluting the sample to be tested, filtering, clarifying or centrifuging clarification; step S2, diluting the standard protein of porcine circovirus type 2 virus like particles determined by protein content and diluting it. A series of standard products were detected by HPLC, and the regression equation was established based on the abscissa and the peak height. S3 was used to detect the peak height of the diluted samples after being tested by HPLC. Step S4, the concentration of porcine circovirus type 2 virus like particles in the tested samples was calculated according to the regression equation and the peak height of the samples. Among them, HPLC was adopted in step S2 and step S3. The chromatographic column was a gel column and the detector was UV detector with a detection wavelength of 280nm.

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法
本专利技术属于生物
，涉及病毒样颗粒的定量检测方法，具体涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法。
技术介绍
猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，是迄今为止发现的最小的病毒，其粒子直径最小仅17nm，DNA基因组长1.7kb，病毒粒子为二十面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒。已知PCV有两个血清型，非致病性的PCV1和致病性PCV2。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS)的主要病原，与猪瘟病毒(CSFV)或猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等混合感染可增强该疾病的严重程度，可造成10％～30％不等的死亡率，较严重的猪场在爆发本病时死淘率高达40％，给养猪业造成严重威胁。目前，PCV2疫苗免疫接种是防控PCV2的主要手段，其抗原含量是影响疫苗免疫效果的最主要的因素。在田间使用时，如无足够与生产实际要求的免疫抗原量，虽然可控制临床发病，但往往因免疫力不足造成猪只感染，表现为长期带毒和亚临床感染，严重影响猪只生长性能，造成较大经济损失。PCV2病毒样颗粒(Virus-LikeParticles，VLPs)是重组表达的PCV2Cap蛋白经自组装形成的60聚体，分子量约为1800kDa，与天然病毒粒子结构相近，所以免疫原性优于Cap蛋白。VLPs的形态结构与天然病毒高度相似，免疫原性良好，且不含有病毒基因，因此是一种理想的疫苗形式。病毒样颗粒疫苗的VLPs结构评价和抗原定量检测是病毒样颗粒疫苗质量控制的重要组成部分，但由于病毒样颗粒是多蛋白组装的大分子物质，一般的生物学定量检测方法难以在定量的同时区分VLPs与蛋白单体，也无法鉴定溶液中病毒样颗粒的稳定状态。目前PCV2抗原定量检测方法主要是酶联免疫吸附测定EnzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA)方法和SDS-PAGE法，而这两种方法均不适用于PCV2VLPs的定量检测：ELISA定量方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，然后进行抗原或抗体的定量，该方法无法区分PCV2VLPs和Cap蛋白单体，同时其捕获抗体对不同基因型的抗原亲和力的差异也限制了该方法的应用；SDS-PAGE法是一种半定量方法，无法准确定量样品中抗原浓度，并且同样也不能区分PCV2VLPs和Cap蛋白单体。高效液相色谱法(HPLC)是一种操作简单、高效和灵敏度高分析方法，检测灵敏度可达ng级，分析速度快，同一样品重复上样后检测结果的相对平均偏差一般不超过2％，目前，HPLC广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。因此，利用HPLC检测技术进行PCV2VLPs的定量分析，不仅能缩短传统的ELISA方法和SDS-PAGE法的检测时间，还能提高检测灵敏度与稳定性，有利于完善PCV2VLPs疫苗生产的质量控制，提高疫苗产品质量。然而，现有HPLC检测方法应用于PCV2VLPs难以适用于PCV2VLPs的定量检测，国内外文献和专利检索也未检索到相关报道，其原因包括：1、PCV2VLPs是由60聚体Cap蛋白组装成的高分子复合物，常规的反相HPLC和正相HPLC在检测时不能保持VLPs的构象；2、酵母细胞破碎后释放出大量的蛋白、核酸和多糖等内溶物，其中一些物质会干扰PCV2VLPs检测信号，甚至可能与PCV2VLPs相互作用，影响检测效果；3、由于PCV2VLPs纯化及定量困难，目前用制作标准曲线的无商品化的标准品。
技术实现思路
为解决上述问题，提供了一种操作简单、灵敏度高、重复性和适用性高的PCV2病毒样颗粒检测方法，本专利技术根据PCV2VLPs的结构特征，设计采用分子排阻层析的色谱检测方法，结合样品处理、标准品的制备以及检测条件优化，建立了高效的HPLC检测PCV2VLPs的纯度及定量方法，解决了生产实际中病毒样颗粒的难以快速定量的关键技术问题。本专利技术具体采用了如下技术方案：本专利技术提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，用于对待测样品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒进行定量检测，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，稀释待测样品并进行过滤澄清或离心澄清；步骤S2，取蛋白含量已被确定的猪圆环病毒2型病毒样颗粒标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行HPLC检测，建立以浓度为横坐标、峰高为纵坐标的回归方程；步骤S3，对稀释后的待测样品进行HPLC检测得到对应的样品峰高；步骤S4，根据回归方程及样品峰高计算得到待测样品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒浓度，其中，步骤S2及步骤S3中的HPLC所采用的色谱柱为凝胶色谱柱，采用的检测器为紫外检测器，其检测波长为280nm。本专利技术提供的上述猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，还可以具有这样的技术特征，其中，凝胶色谱柱为AgilentBioSEC-5或TSKgelG4000SWXL。本专利技术提供的上述猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，还可以具有这样的技术特征，其中，步骤S1中，待测样品的稀释采用磷酸缓冲液进行，该磷酸缓冲液中含有150mMNaCl、2.7mMKCl、1.5mMKH2PO4以及8mMK2HPO4。本专利技术提供的上述猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，还可以具有这样的技术特征，其中，待测样品选自重组工程菌的发酵液、细胞培养液、分离纯化液或抗原成品中的任意一种。本专利技术提供的上述猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，还可以具有这样的技术特征，其中，待测样品采用含1％TritonX-100的磷酸盐缓冲液进行20倍稀释。本专利技术提供的上述猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，还可以具有这样的技术特征，其中，病毒样颗粒在HPLC的保留时间为15.5min。本专利技术还提供了另一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，稀释待测样品并进行过滤澄清或离心澄清；步骤S2，取蛋白含量已被确定的猪圆环病毒2型病毒样颗粒标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行HPLC检测，建立以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标的回归方程；步骤S3，对稀释后的待测样品进行HPLC检测得到对应的样品峰面积；步骤S4，根据回归方程及样品峰面积计算得到待测样品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒浓度，其中，步骤S2及步骤S3中的HPLC所采用的色谱柱为凝胶色谱柱，采用的检测器为紫外检测器，其检测波长为280nm。专利技术作用与效果根据本专利技术提供的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，由于采用了基于凝胶色谱柱的HPLC中来对病毒样颗粒进行检测，因此能够有效地分离病毒样颗粒和杂质，达到检测病毒样颗粒的目的。进一步，采用本专利技术的凝胶色谱柱以及HPLC条件还能够使非多聚化形式的病毒样颗粒和多聚化形式的病毒样颗粒得到分离，从而能够区分病毒样颗粒的不同聚合形式，更适用于实际生产过程的产品检测和质量控制。附图说明图1为本专利技术实施例的PCV2病毒样颗粒标准品的HPLC检测结果；图2为本专利技术实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，用于对待测样品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒进行定量检测，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，稀释所述待测样品并进行过滤澄清或离心澄清；步骤S2，取蛋白含量已被确定的猪圆环病毒2型病毒样颗粒标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行HPLC检测，建立以浓度为横坐标、峰高为纵坐标的回归方程；步骤S3，对稀释后的所述待测样品进行HPLC检测得到对应的样品峰高；步骤S4，根据所述回归方程及所述样品峰高计算得到所述待测样品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒浓度，其中，步骤S2及步骤S3中的HPLC所采用的色谱柱为凝胶色谱柱，采用的检测器为紫外检测器，其检测波长为280nm。

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，用于对待测样品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒进行定量检测，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，稀释所述待测样品并进行过滤澄清或离心澄清；步骤S2，取蛋白含量已被确定的猪圆环病毒2型病毒样颗粒标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行HPLC检测，建立以浓度为横坐标、峰高为纵坐标的回归方程；步骤S3，对稀释后的所述待测样品进行HPLC检测得到对应的样品峰高；步骤S4，根据所述回归方程及所述样品峰高计算得到所述待测样品中的猪圆环病毒2型病毒样颗粒浓度，其中，步骤S2及步骤S3中的HPLC所采用的色谱柱为凝胶色谱柱，采用的检测器为紫外检测器，其检测波长为280nm。2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，其特征在于：其中，所述凝胶色谱柱为AgilentBioSEC-5或TSKgelG4000SWXL。3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，其特征在于：其中，步骤S1中，所述待测样品采用含1％TritonX-100的磷酸盐缓冲液进行20倍稀释。4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的定量检测方法，其特征在于：其中，步骤S1中，所述待测样...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕红，周峻岗，段进坤，杨德强，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31