一种CD133质谱流式抗体、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种CD133质谱流式抗体、制备方法及应用，所述CD133质谱流式抗体是以镧系金属溶液和CD133纯抗体为原料，将镧系金属负荷到CD133纯抗体上后制备而成的。该抗体的制备方法包括以下步骤：制备金属负荷物溶液，CD133抗体还原，纯化金属负荷物，纯化CD133抗体，制备CD133抗体复合物，清洗CD133抗体复合物等步骤。本发明专利技术制成的CD133质谱流式抗体体填补了现有技术的空白，质谱流式检测的抗体，可以作为质谱流式研究干细胞的标志物，拓展了质谱流式技术研究干细胞新的领域。

A Flow Antibody for CD133 Mass Spectrometry, Its Preparation and Application

The invention belongs to the field of biotechnology, and specifically discloses a CD133 mass spectrometry flow antibody, its preparation method and application. The CD133 mass spectrometry flow antibody is prepared by loading lanthanide metal solution and CD133 pure antibody as raw materials and loading lanthanide metal onto CD133 pure antibody. The preparation method of the antibody includes the following steps: preparation of metal carrier solution, reduction of CD133 antibody, purification of metal carrier, purification of CD133 antibody, preparation of CD133 antibody complex and cleaning of CD133 antibody complex. The CD133 mass spectrometry flow antibody body made by the invention fills in the blank of the existing technology. The antibody detected by mass spectrometry flow can be used as a marker of mass spectrometry flow study of stem cells, and expands the new field of mass spectrometry flow study of stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种CD133质谱流式抗体、制备方法及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种CD133质谱流式抗体、制备方法及应用。
技术介绍
流式技术是最经典的单细胞检测技术，能够对细胞进行多参数检测。传统流式使用荧光基团偶联抗体，利用荧光光路，检测细胞表面标志。传统的流式技术是基于荧光检测系统，但是由于不同荧光基团发射光谱的重叠，会导致通道间的信号相互干扰，当检测通道多于8个的时候，补偿调节极大的依赖于人工经验，使得实验设计和补偿计算则变得十分复杂。现在新兴发展的质谱流式技术，采用金属元素偶联抗体，通过质谱技术区分细胞的形态。新型的质谱流式的检测系统和标签系统与传统流式技术不同，传统的流式技术是基于荧光检测系统而新型的质谱流式技术采用金属元素作为标签与抗体结合；传统流式技术采用激光器和电子倍增管作为检测手段，新型的质谱流式使用ICP质谱技术作为检测手段。新型的质谱流式技术通过对传统的流式技术和质谱技术进行结合，彻底解决了荧光补偿问题，并实现了最多130个标志同时检测，而现在最顶级配置的BD流式细胞仪，至多同时检测50个标志。质谱流式其强大的数据获取能力和生物信息学紧密相连，对原有的数据进行了深度挖掘。CD133抗体常表达于未成熟的造血干细胞或祖细胞，有报道认为它在脑肿瘤、前列腺癌、小鼠的Lewis肺癌、B16黑色素瘤的干细胞中均有表达，已被认为是这些肿瘤干细胞的标志之一。已有报道发现，在多种肿瘤细胞系上发现有CD133两种抗原mRNA的表达。CD133-2抗原的mRNA在肺癌细胞系、胰腺癌细胞系以及乳腺癌细胞系等细胞表面高表达，而CD133-1抗原的mRNA高表达于视网膜母细胞癌细胞系以及与其起源相同的癌细胞表面。作为干细胞特异性表面抗原，CD133的mRNA能在多种癌细胞系中检测到，提示CD133是一种肿瘤干细胞的广谱标记物，是一种独特的干细胞标志，分子量为120kDa，具有5个跨膜区，曾命名为AC133。2000年，在英国Harrogate举行的第7届人类白细胞分化抗原国际工作会议(7thInternationalWorkshoponHumanLeucocyteDifferentiationAntigens，HLDA7)上被正式命名为CD133。可用于筛选一些尚未分选出的肿瘤干细胞或者进一步纯化已分选出的肿瘤干细胞。然而由于质谱技术是一个新生发展的技术，目前市场市售的质谱流式单抗不过300种左右，大部分质谱流式抗体都需自行合成，缺乏成品的CD133质谱流式的抗体，限制了CD133作为肿瘤干细胞广谱标记物的应用。
技术实现思路
本专利技术提供的一种CD133质谱流式抗体、制备方法及应用，该CD133质谱流式抗体填补了现有技术的空白，质谱流式检测的抗体，具有良好的应用前景。本专利技术提供了一种CD133质谱流式抗体，所述CD133质谱流式抗体是以镧系金属溶液和CD133纯抗体为原料，将镧系金属负荷到CD133纯抗体上后制备而成的。本专利技术提供了一种CD133质谱流式抗体的制备方法，包括以下步骤：S1，制备金属负荷物溶液：配制镧系金属溶液，37℃孵育30-40min，得到金属负荷物溶液；S2，CD133抗体还原：向截留分子量50kDa离心超滤管中加入R-Buffer和CD133纯抗体，混匀，离心，弃上清，向得到的沉淀中加入TCEP-R-Buffer，混匀，37℃孵育15-30min，得到还原的抗体溶液；其中，每1000μL的TCEP-R-Buffer的配制方法如下：向8μL0.5MTCEP溶液中加入992μLR-Buffer，混匀；S3，纯化金属负荷物：向截留分子量3kDa离心超滤管中加入L-Buffer，再加入S1得到的金属负荷物溶液，混匀，离心，继续加入C-Buffer，混匀，离心，回收沉淀；S4，纯化CD133抗体：向S2获得的抗体溶液中加入C-Buffer，离心，弃上清，然后再加入C-Buffer混匀，离心，弃上清，回收的沉淀，该沉淀为纯化的CD133抗体；S5，制备CD133抗体复合物：用C-Buffer重悬S3中回收的沉淀，并将重悬液与S4中得到的纯化的CD133抗体混匀，37℃孵育60-120min，得到CD133抗体复合物；S6，清洗CD133抗体复合物：用W-Buffer清洗S5中得到的CD133抗体复合物，得到干净的CD133质谱流式抗体；其中R-Buffer的作用是抗体缓冲液；L-Buffer和C-Buffer的作用是镧系金属缓冲液；W-Buffer的作用是清洗液。优选的，上述CD133质谱流式抗体的制备方法中，S1中，所述镧系金属溶液的终浓度为2.5mM，所述镧系金属为氯化镱或者氯化镧。优选的，上述CD133质谱流式抗体的制备方法中，S2中，R-Buffer：CD133纯抗体：TCEP-R-Buffer的体积比例为300：100-200：100。优选的，上述CD133质谱流式抗体的制备方法中，S3中，金属负荷物溶液、L-Buffer和C-Buffer的体积比例为100：200：300。优选的，上述CD133质谱流式抗体的制备方法中，S4中，第一次加入的C-Buffer、第二次加入的C-Buffer以及S2中加入的TCEP-R-Buffer的体积比例为300：400-500：100。优选的，上述CD133质谱流式抗体的制备方法中，S6的具体步骤如下：向S5得到的含有CD133抗体复合物的50kDa离心超滤管中加入300μLW-Buffer，混匀，12,000g离心10min，弃上清，再用400μLW-Buffer洗涤沉淀三次，最后加入50μLW-buffer，冲洗，收集超滤管内溶液A；然后将该离心超滤管1000g离心2min，再用50μLW-buffer冲洗管壁，收集超滤管内溶液B，合并超滤管内溶液A和溶液B，得到干净的CD133质谱流式抗体。本专利技术提供了上述的CD133质谱流式抗体作为质谱流式检测干细胞标志物的应用。本专利技术提供了上述的CD133质谱流式抗体的制备方法在制备质谱流式检测干细胞标志物中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供的一种CD133质谱流式抗体、制备方法及应用，具有以下有益效果：在此专利技术之前，质谱流式抗体不存在镧系金属负荷的CD133质谱流式抗体，在质谱流式研究研究干细胞，细胞早起分化中缺乏这样的标志性CD133质谱流式抗体，限制了质谱流式技术的应用范围，本专利技术通过构合成新的镧系金属负荷的CD133质谱流式抗体，可在所有活细胞中表达，且表达量高，填补了市场的空白，对质谱流式检测干细胞标志提供了新的靶抗体，拓展了质谱流式技术研究干细胞新的领域。附图说明图1是本专利技术实施例的CD133质谱流式抗体(图中简称172Yb_CD133(v))未设定圈门的表达情况；其中图1A是未设定圈门172Yb_CD133(v)的整体表达情况，图1B是TSNE1多维数据降维后生成的通道情况，图1C是TSNE2多维数据降维后生成的通道情况。图2是本专利技术实施例的CD133质谱流式抗体(图中简称172Yb_CD133(v))在活细胞中的表达情况；其中图2A是172Yb_CD133(v)的整体表达情况，图2B是TSNE1多维数据降维后生成的通道情况，图2C是TSNE2多维数据降维后生成的通道情况。图3是本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CD133质谱流式抗体，其特征在于，所述CD133质谱流式抗体是以镧系金属溶液和CD133纯抗体为原料，将镧系金属负荷到CD133纯抗体上后制备而成的。

【技术特征摘要】
2017.12.28 CN 20171149995221.一种CD133质谱流式抗体，其特征在于，所述CD133质谱流式抗体是以镧系金属溶液和CD133纯抗体为原料，将镧系金属负荷到CD133纯抗体上后制备而成的。2.根据权利要求1所述的CD133质谱流式抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，制备金属负荷物溶液：配制镧系金属溶液，37℃孵育30-40min，得到金属负荷物溶液；S2，CD133抗体还原：向截留分子量50kDa离心超滤管中加入R-Buffer和CD133纯抗体，混匀，离心，弃上清，向得到的沉淀中加入TCEP-R-Buffer，混匀，37℃孵育15-30min，得到还原的抗体溶液；其中，每1000μL的TCEP-R-Buffer的配制方法如下：向8μL0.5MTCEP溶液中加入992μLR-Buffer，混匀；S3，纯化金属负荷物：向截留分子量3kDa离心超滤管中加入L-Buffer，再加入S1得到的金属负荷物溶液，混匀，离心，继续加入C-Buffer，混匀，离心，回收沉淀；S4，纯化CD133抗体：向S2获得的抗体溶液中加入C-Buffer，离心，弃上清，然后再加入C-Buffer混匀，离心，弃上清，回收的沉淀，该沉淀为纯化的CD133抗体；S5，制备CD133抗体复合物：用C-Buffer重悬S3中回收的沉淀，并将重悬液与S4中得到的纯化的CD133抗体混匀，37℃孵育60-120min，得到CD133抗体复合物；S6，清洗CD133抗体复合物：用W-Buffer清洗S5中得到的CD133抗体复合物，得到干净的CD133质谱流式抗体；其中R-Buffer的...

【专利技术属性】
技术研发人员：成慧娟，李玉民，陈昊，王德贵，王芳，张丽娟，孙婧，韩志坚，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62