一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法技术

本发明专利技术公开了一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，P1修饰的金电极和p300蛋白的检测体系中加入P2模板化银纳米粒子和葫芦[8]脲，通过电化学测量检测p300蛋白的活性，从而得到蛋白质转移化酶活性；所述P1的氨基酸序列为：11‑巯基十一烷酸(MUA)‑GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列为：FGGGASLWWSEKL。以p300为模型，以信号模板P2合成银纳米粒子，通过腔体与传感模板P1进行组装，既保证了检测的灵敏性，又具有高度的设计灵活性，同时增强了HATs的选择性。发展能够检测HATs活性的简单、实用的电化学方法，有望为重大疾病的早期诊断提供帮助。

An electrochemical method for detecting protein acetyltransferase activity

The invention discloses an electrochemical method for detecting protein acetyltransferase activity, in which P2 template silver nanoparticles and cucurbit [8] urea are added to the gold electrode modified by P1 and the detection system of P300 protein, and the activity of P300 protein is detected by electrochemical measurement, thereby obtaining the activity of protein transferase; the amino acid sequence of the P1 is 11 mercaptoundecanoic acid (MUA)GGGKGLG KGGAKA; the amino acid sequence of the P2 is FGGASLWWSEKL. Silver nanoparticles were synthesized by signal template P2 and assembled by cavity and sensor template P1, which not only ensured the sensitivity of detection, but also had high design flexibility, and enhanced the selectivity of HATs. The development of simple and practical electrochemical methods to detect HATs activity is expected to provide help for the early diagnosis of major diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法
本专利技术属于生物电化学检测
，具体地，涉及一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法。
技术介绍
1931年，Warburg医生凭借“癌症是代谢性疾病”的重大发现，获得诺贝尔生理学和医学奖。美国多所大学的研究也证实：基因不是癌症产生的根本因素，掌控癌症产生的是细胞质。正常细胞质和癌细胞质的区别，就是代谢的不同，因此，代谢障碍才是细胞癌变的根源。根据相关标准估计，2015年全世界约有1/4的人口患有代谢综合征（metabolicsyndrome，MS），我国的患病率为16.5%，年龄标化后男女患病率分别为10.0%和23.3%，北方患病率高于南方，城市患病率高于农村。研究发现，83%的糖尿病患者和51%心脑血管疾病是由于MS引起，而大多数高血压的发生也由MS引起。我国现有7700万MS患者，即每8个成年人中至少有1人患有MS，这超过了目前其他任何一种疾病的患病率。通过广州市体检人群的研究表明，普通人群的MS患病率以平均每年0.97%的速度递增。2014年在重庆市35岁及以上人群中调查得出MS标化患病率为18.72%，女性（25.55%）显著高于男性（12.90%）。MS以肥胖、血压升高、血糖升高以及血脂异常为主要临床表现，多种危险因子汇聚于同一个个体，是严重影响人类健康的代谢性疾病。但是，MS的早期症状并不明显，临床上主要通过测试患者的身高、体重、血压，以及血糖、血脂的指标进行综合评估。这种评估缺乏直接的证据，确诊率较低，失去了最佳的治疗时机。在此背景下，发展有效的MS早期检测技术成为MS治疗领域急需解决的问题之一。早期检测蛋白乙酰转移酶(HATs)活性的方法主要依赖于放射自显影法及放射性同位素标记，该传统检测方法存在放射性标记耗时费力、成本高及对环境污染较大等缺点。多种HATs自身作用于底物并无法完成反应，还需要共反应物乙酰辅酶A提供乙酰基才能进行乙酰化反应，在这过程中会产生辅酶A，建立一种方法定量其副产物，也同样能够间接地检测HATs的活性，但是对酶的间接检测是其无法克服的缺陷。另外，还易受到反应液中其他还原性物质或者其它巯基小分子的干扰，从而导致灵敏度的提高受到限制。通过酶联免疫（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）的方法对HATs进行的检测已经进入了商品化。依赖酶联免疫吸附的原理是将组蛋白H3和H4的氨基末端尾部与抗原决定簇标记的麦芽糖结合蛋白质连接产生融合蛋白。该融合蛋白发生反应后，经凝胶电泳分离后，通过显色来检测酶反应活性。在乙酰化抗体识别的方法上，2011年MollyM.Stevens教授设计了一种依赖于乙酰化特异性抗体底物多肽调控与量子点间的荧光能量共振转移进行HATs检测的传感器。同样的还有基于乙酰化抗体介导的金纳米颗粒（AuNPs）组装策略。2013年JiangJianhui课题组基于上述思路报道了比色的方法用于HATs检测。基于酶联免疫和乙酰化抗体识别的方法是乙酰化相关酶活性检测的主导工具，但是存在着如抗体批次之间的差异、抗体标记的高成本和复杂探针的制备等缺点。MinoruYoshida课题组自2009年以来，发表了一系列文章报道了基于溴结构域特异性识别乙酰化的方法用于乙酰化相关酶的检测，对多种细胞内的乙酰化水平实现实时连续地监测。B.Devipriya等设计了一种漆树酸（Anacardicacid，AA）与p300绑定的复合体，AA作为HATs抑制剂，对HATs的活性起到抑制作用，通过分别检测气态AA以及AA-p300复合体的分子构象、电荷密度分布、静电作用，得出AA进入p300活泼位点前后的差异性，通过这种差异性的改变，进而评估HATs活性。YufangHu等设计一种辅酶A-Ag+/GO（氧化石墨烯）修饰的玻碳电极，在氮气氛中催化氧化双氧水产生电信号，与蛋白质乙酰化过程中参与的HATs建立线性关系，进而检测HATs的活性，线性范围0.1~100nM，检测限0.067nM。近年来，受到生物矿化作用的启发，多肽被越来越多地作为模板引导金纳米颗粒、银纳米颗粒、铜纳米颗粒、磁性纳米颗粒以及量子点等无机纳米材料的“绿色”合成。不同于化学合成中所需的高温、高压等条件，多肽模板化纳米材料的合成条件更为温和，通常发生在室温的中性水溶液环境中。与此同时，特定的多肽序列可以随着合成模板一起结合到纳米材料表面，避免了繁琐的化学修饰过程，使多肽与纳米材料的结合更为简便、高效且易于控制。PhilippGraf等合成了二氧化硅包裹的多肽模板化银纳米颗粒，合成条件非常温和，在纳米颗粒低浓度情况下，具有很好的化学稳定性和生物相容性，这种生物模拟的软化学合成材料将会应用于生物体内光学器件和传感器的构建。多肽模板化纳米材料应用于催化无机小分子，HongyuYang等在玻碳电极表面修饰多肽（R5）模板化的钯纳米线，用于催化碱性环境中氧的电解还原反应。RohitBhandari等合成了多肽（R5）模板化的钯和铂纳米材料，用于烯丙醇的催化加氢反应、Stille偶联反应和对硝基苯酚的氢化还原反应。NicholasA.Merrill等合成多肽（R5）模板化的双金属钯-铂纳米材料用于烯烃的催化加氢反应。多肽模板化纳米材料应用于生物分子检测，YuanyuanZhang等在金电极表面修饰多肽链，利用目标生物分子TGase2（转谷氨酰胺酶）在多肽链上生长，营造生物矿化模拟环境，吸附和还原Ag+生成金属Ag产生电信号。此项研究成果已经应用于子痫前期临床实践。QianWen等开发了一种多肽模板化的、实时的、免标记的金纳米族信号传感系统，通过荧光技术检测两种蛋白质修饰酶——HDACs和PKA（蛋白激酶A），其中HDACs的检测范围从15pM至30nM，检测限5pM。因此，多肽模板化纳米材料为发展以多肽为底物的蛋白质修饰酶活性检测新方法提供了无限的选择空间。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术建立了一种基于葫芦脲[8]（CB[8]）模板自组装的HATs活性检测的电化学方法。技术方案：本专利技术提供了一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，包括以下步骤：P1修饰的金电极(P1/AuE)和p300蛋白的检测体系中加入P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs）和葫芦[8]脲（CB[8]），通过电化学测量检测p300蛋白的活性，从而得到蛋白质转移化酶活性；所述P1的氨基酸序列为：11-巯基十一烷酸(MUA)-GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列为：FGGGASLWWSEKL。本专利技术所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，方法合理，本专利技术提供了一段氨基酸序列为P1：11-巯基十一烷酸(MUA)-GGGFRGKGGKGLGKGGAKA的多肽探针，其中半胱氨酸C可以通过Au-S键实现多肽探针在金电极表面的自组装，得到P1修饰的金电极(P1/AuE)。苯丙氨酸F可以通过与葫芦[8]脲（CB[8]）的主客识别作用结合P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs），而赖氨酸K可以在p300蛋白的作用下发生乙酰化（Ac）。当检测体系中没有p300时，自组装在金电极表面的多肽探针P1可以在羧肽酶Y（carboxypeptidaseY，CPY，一种来自酵母的不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：P1修饰的金电极和p300蛋白的检测体系中加入P2模板化银纳米粒子和葫芦[8]脲，通过电化学测量检测p300蛋白的活性，从而得到蛋白质转移化酶活性；所述P1的氨基酸序列为：11‑巯基十一烷酸‑GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列为：FGGGASLWWSEKL。

【技术特征摘要】
1.一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：P1修饰的金电极和p300蛋白的检测体系中加入P2模板化银纳米粒子和葫芦[8]脲，通过电化学测量检测p300蛋白的活性，从而得到蛋白质转移化酶活性；所述P1的氨基酸序列为：11-巯基十一烷酸-GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列为：FGGGASLWWSEKL。2.根据权利要求1所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述P1修饰的金电极的制备方法：包括以下步骤：（1）金电极在麂皮上依次用1μm，0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液打磨成镜面；（2）用H2SO4:H2O2为3:1的溶液浸泡清洗；（3）金电极分别在双蒸水和乙醇中超声清洗；（4）金电极在50%硝酸中浸泡30min，然后在0.5M的H2SO4中电化学清洗，扫描电压从0V至1.5V，循环30次；（5）金电极用氮气吹干，再将金电极浸入100μL，0.5μM的P1溶液，浸泡16h后，金电极温育在1mM的巯基己醇30min，之后双蒸水清洗，得所述P1修饰的金电极。3.根据权利要求2所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述P1溶液中加入磷酸三氯乙酯。4.根据权利要求1所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述P2模板化银纳米粒子的合成方法，包括以下步骤：将0.2mM的AgNO3和100ng/μL的P2混合在5mL的水溶液中，磁力搅拌20min；混合溶液中加入2mM的NaBH4...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗向阳，吴昀，王杨，郁惠珍，顾准，
申请(专利权)人：苏州健雄职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32