一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法技术

本发明专利技术属于离子选择性微电极技术领域，具体涉及一种基于非损伤微测技术（NMT）的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法，通过向微电极玻璃管内灌入长约1cm的连续无气泡灌充液，灌充液由1mM硝酸铜和0.1mM氯化钾溶液组成；再在显微镜下从尖端吸入一段长约40‑50µm的权利要求1所述的铜离子交换剂，并确保铜离子交换剂与灌充液之间无间隙无气泡。采用此配方制作的微电极成功地用于了测定植物根尖表面的铜离子流速。本发明专利技术建立了一种可用于NMT技术的Cu

A copper ion selective microelectrode based on non-invasive micrometry and a method for measuring copper ion flow rate in plant root tips

The invention belongs to the field of ion-selective microelectrode technology, in particular to a copper ion-selective microelectrode based on non-invasive micro-measurement technology (NMT) and a method for measuring the copper ion flow rate in plant root tips. A continuous non-bubble filling solution of about 1 cm in length is injected into the glass tube of the microelectrode. The filling solution consists of 1 mM copper nitrate and 0.1 mM potassium chloride solution, and then is absorbed from the tip under a microscope. Enter the copper ion exchanger described in claim 1 of a length of about 40 m and ensure that there is no gap and no bubbles between the copper ion exchanger and the filling solution. Microelectrodes fabricated with this formulation have been successfully used to determine the flow rate of copper ions on the surface of plant root tips. The invention establishes a copper which can be used in NMT technology.

【技术实现步骤摘要】
一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法
本专利技术属于离子选择性微电极
，具体涉及一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法。
技术介绍
非损伤微测技术(NMT)是一种新近发展起来的离子选择性微电极技术，可在不损伤活体样品的情况下获得进出样品的各种离子或分子浓度、流速及方向的信息。目前,NMT可以测量H+、Ca2+、K+、NH4+、Na+、Cd2+、NO3-、Cl-、O2等多种离子和分子，但由于缺乏可靠的Cu2+离子交换剂，NMT技术尚无法用于测量活体样品表面的Cu2+流速。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术旨在提供一种考察了铜离子选择性液膜微电极的特征(斜率、选择性系数、pH范围)，测定植物根尖铜离子流速，并初步建立了测定植物根表铜离子流速的NMT技术的基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极以及植物根尖铜离子流速测定方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于非损伤微测技术的铜离子交换剂，其特征在于，由1.0％铜(II)离子载体、1.0％四[3,5-二(三氟甲基)苯基]硼酸钠、98.0％2-硝基苯辛醚组成。一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极的制备方法，向一支微电极玻璃毛细管内灌入一段长约1cm的连续灌充液液柱，灌充液由1mM硝酸铜和0.1mM氯化钾溶液组成；再在显微镜下从尖端吸入一段长约40-50μm的所述的铜离子交换剂，并确保铜离子交换剂与灌充液之间无间隙无气泡；在微电极内的灌充液中插入银丝，并连接微电极夹持器，从而制成适用于NMT系统的铜离子选择性玻璃微电极。铜离子选择性微电极的校准步骤如下：将上述制作好的铜离子选择性微电极与前置放大器相连接，调节微操纵仪将微电极尖端浸入校正液中，同时将Ag/AgCl参比电极尖端也浸入校正液中；借助于摄像头和视频采集软件观察微电极，确保尖端无离子交换剂的泄漏之后开始测定；将参比电极、微电极依次浸入校正液中，开启NMT系统测定并记录电位值；校正液为硝酸铜，初始浓度为10000μM、5000μM，将其分别逐级稀释10倍，分别测定它们的电位值，直至测定值不随校正液中铜浓度的变化而变化；根据校正液中铜离子的活度和测得的电位值，应用能斯特方程即可计算出微电极的斜率；以上为探究理想状态下微电极特征时所采用的方法，在将微电极技术应用于植物活体样品测定时需要采用维持生物活性的缓冲液，因而校正液的组成应作调整；调整后的校正液除分别含有1000μM，100μM，10μM，1μM铜离子外，还含有0.1mM氯化钙，0.1mM氯化钾，0.3mMMES，pH6.0。选择性系数的测定步骤如下：采用等活度法测定选择性系数；根据浓度活度换算表，以下溶液与10000μM硝酸铜溶液活度相等，都为5955μM：10000μM硝酸钙，10000μM硝酸锌，9580μM硝酸镁，10250μM硝酸铬，10400μM硝酸铅，6330μM硝酸钠，6340μM硝酸钾，6340μM硝酸铵；在非损伤微测系统中，采用上述方法制备的铜离子选择性微电极分别测定它们的电位值，并应用以下公式计算选择性系数：其中，A为主离子，B为干扰离子；在本试验中，A为铜离子，B为钙离子、锌离子、镁离子、铬离子、铅离子、钠离子、钾离子、铵离子；zA和zB分别为A和B的电荷数；aA为主离子A的活度(干扰离子B的活度aB＝aA)；EA和EB为等活度的A溶液和B溶液的电位测定值；表示选择性系数，即A离子选择性电极对干扰离子B的电位选择性系数；R为气体常数，F为法拉第常数，T为绝对温度。判断介质pH对流速测定的影响的实验步骤为：配制50μM硝酸铜，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液分别调pH至4.0,5.0,6.0,7.0,8.0，在非损伤微测系统中，采用本试验制备的铜离子选择性微电极，分别测定电位值。本专利技术还提供采用上述的制备方法得到的铜离子选择性微电极及其特征参数。采用前述铜离子选择性微电极对植物根尖铜离子流速进行测定的方法，包括如下步骤：在实验室采用水培方式培育白羽扇豆、吊兰，选择生长旺盛、根系健康的植株用于测定；将铜离子选择性微电极固定于夹持器上，采用前述方法校正并获得斜率；在塑料培养皿中加入测试液，用滤纸片和树脂块固定白羽扇豆根部，露出根尖；将铜离子选择性微电极和Ag/AgCl参比电极尖端浸入测试液中，调节微操纵仪，使微电极尖端靠近根表；设置NMT测试参数，由数据收集系统开始记录测得的电位值；采用NMT系统的数据转换软件，将测定值转换为离子流速信息；相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术建立了一种可用于NMT技术的Cu2+交换剂配方，以此制作的离子选择性玻璃微电极具有稳定的斜率和较高的选择性系数，可用于NMT技术测定活体样品表面的铜离子流速，扩大了NMT技术的应用范围。附图说明图1铜离子选择性微电极对铜离子活度的响应曲线；图2铜离子选择性微电极的校准曲线；图3测试液背景下铜离子选择性微电极的校准曲线；图4介质pH对铜离子微电极测定值的影响；图5吊兰根尖的铜离子流速(负值表示内流)；图6白羽扇豆种子根根尖的铜离子流速(负值表示内流)。具体实施方式以下通过具体实例对本专利技术作进一步详细说明。植物的铜营养生理铜元素是植物生长发育所必须的微量元素，大多数植物的含铜量在5-25mg/kg(干重)，多集中于幼嫩叶片、种子胚等生长活跃的组织中，而茎杆和成熟的叶片中较少。植物含铜量常因植物种类、植株部位、成熟状况、土壤条件等因素而有变化，且不同种类作物体内的含量差异很大。植物吸铜受代谢作用的控制，根系中的铜含量往往比地上部高，尤其是根尖。植物地上部是种子和生长旺盛部位含铜量较高。铜的移动取决于体内铜的营养水平。供铜充足时，铜较易移动；而供应不足时。铜则不易移动。在污染环境条件下过量的铜又成为危害植物生长的常见重金属元素。对于一般作物来讲，含铜量＞20mg/kg干重时，作物就可能中毒。铜中毒的症状时新叶失绿，老叶坏死，叶柄和叶的背面出现紫红色。植物对铜的忍耐能力有限，铜过量很容易引起毒害。铜对植物的毒害首先表现在根部，因为植物体内过多的铜主要集中在根部，具体表现为主根的伸长受阻，侧根变短。许多研究者认为，过多铜对质膜结构有损害，从而导致根内大量物质外溢。非损伤微测技术非损伤微测技术(non-invasivemicro-testtechnique，NMT)是一种选择性离子/分子微电极技术。非损伤微测技术是一大类微电极技术的统称，包括：离子选择性电极技术(SIET)、扫描极谱电极技术(SPET)、自参比离子选择性电极技术(SERIS)、自参比极谱电极技术(SERP)、自参比酶辅助电极技术(SERE)、扫描参比微电极技术(SRET)、微电极离子流技术(MIFE)、扫描振动电极技术(SVET)。自从1974年美国海洋生物学实验室(MarineBiologicalLaboratory)的神经科学家LionelF.Jaffe提出非损伤微测技术(non-invasivemicro-testtechnique,NMT)原初概念,到1990年成功应用于测定细胞Ca2+运动方向和流速,该技术已经解决了众多科学问题。NMT是实时选择性测定进出活体材料离子和小分子流速的技术,是生理功能研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于非损伤微测技术的铜离子交换剂，其特征在于，由1.0％铜(II)离子载体(N,N,N′,N′‑四环己基‑2,2′‑硫代二乙酰胺)、1.0％四[3,5‑二(三氟甲基)苯基]硼酸钠和98.0％2‑硝基苯辛醚组成。

【技术特征摘要】
1.一种基于非损伤微测技术的铜离子交换剂，其特征在于，由1.0％铜(II)离子载体(N,N,N′,N′-四环己基-2,2′-硫代二乙酰胺)、1.0％四[3,5-二(三氟甲基)苯基]硼酸钠和98.0％2-硝基苯辛醚组成。2.一种基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极的制备方法，其特征在于，向一支玻璃微电极管灌入一段长约1cm的连续无气泡灌充液液柱，连续无气泡灌充液液柱由1mM硝酸铜和0.1mM氯化钾溶液组成，再在显微镜下从尖端吸入一段长约40-50μm的权利要求1所述的铜离子交换剂，并确保铜离子交换剂与灌充液之间无间隙无气泡；在微电极的灌充液中插入银丝，并连接微电极夹持器，则铜离子选择性微电极制作完成。3.基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极的测定方法，其特征在于，铜离子选择性微电极的校准和斜率测定方法如下：将权利要求2制作好的铜离子选择性微电极与前置放大器相连接，调节微操纵仪将微电极尖端浸入校正液中，同时将Ag/AgCl参比电极尖端也浸入校正液中；打开摄像头和视频采集软件观察微电极尖端，确保无泄漏后开始校正；将参比电极、铜离子选择性微电极依次浸入校正液中测定电位值，并求得微电极的特征参数；校正液为硝酸铜，初始浓度设置为10000μM、5000μM，将其分别进行逐级稀释，分别测定电位值，直至测定值趋于不变；根据校正液中铜离子的活度和测得的电位值，应用能斯特方程即可计算出微电极的斜率；以上为探究理想状态下微电极特征时所采用的方法，在将微电极技术应用于植物活体样品测定时需要采用维持生物活性的缓冲液，因而校正液的组成应作调整；调整后的校正液除分别含有1000μM，100μM，10μM，1μM铜离子外，还含有0.1mM氯化钙，0.1mM氯化钾，0.3mMMES，pH6.0。4.根据权利要求3所述的基于非损伤微测技术的铜离子选择性微电极的特征参数的测定方法，其特征在于，选择性系数的测定步...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪晓丽，熊健，封克，王小兵，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32