一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法技术

本发明专利技术公开一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法，所述离子通道阅读器包括自动移液工作平台、光源、原子化器、光学系统和检测器；包括以下步骤：1)细胞的培养与相关溶液配置；2)仪器测定细胞裂解液内Rb+浓度及仪器条件；3)标准工作曲线绘制。本发明专利技术克服了离子共转运通道因电中性无法使用膜片钳检测的困难，同时规避了荧光标记和同位素标记存在的结果误差和安全隐患，为氯离子共转运蛋白的活性检测提供了全新的方法；本发明专利技术的离子通道阅读器实现取样，进样和清洗全自动化，同时采用了微量进样技术，使待检测样品用量达到微升级别，符合细胞实验微量需求。本发明专利技术构建了稳定的实验系统环境，节省人力物力，减少实验结果误差。

An Ion Transport Channel Activity Analysis Method Based on Ion Channel Reader

The invention discloses an ion transport channel activity analysis method based on an ion channel reader, which comprises an automatic liquid transfer platform, a light source, an atomizer, an optical system and a detector. The ion channel reader comprises the following steps: 1) cell culture and configuration of related solutions; 2) instrument determination of Rb + concentration in cell lysate and instrument conditions; 3) drawing of standard working curve; \u3002 The invention overcomes the difficulty that the ion co-transport channel can not be detected by patch clamp due to the electric neutrality, avoids the result error and safety hidden danger of fluorescence labeling and isotope labeling, and provides a new method for the activity detection of chloride co-transport protein; the ion channel reader of the invention realizes the automation of sampling, sampling and cleaning, and adopts micro-sampling. The technology makes the amount of samples to be tested reach micro-upgrade, which meets the micro-requirement of cell experiments. The invention constructs a stable experimental system environment, saves manpower and material resources, and reduces experimental results error.

【技术实现步骤摘要】
一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法
本专利技术涉及一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法，属于医学领域。
技术介绍
脂质双分子层作为细胞膜的主要组成部分使其极具疏水性，把细胞内外环境隔绝起来。生物体内一些非自由扩散的亲水小分子物质(例如离子)跨越细胞膜进出细胞需要借助膜转运蛋白完成。离子转运蛋白是存在于细胞膜上的蛋白通道，通过能量消耗选择性协助离子的跨膜运输，使其在细胞内外达到适度的浓度梯度，形成一定的膜电位差。协同转运蛋白是转运蛋白的一种，允许两种或以上的离子主动转运。例如，Na-K-Cl协同转运蛋白(NKCC)在正常的生理情况下以1∶1∶2的比例同向推送钠、钾和氯离子，因此亦称为氯离子共转运通道。然而离子共转运通道介导的转运过程整体呈电中性，通过传统的膜片钳检测电流是不可行的。用荧光标记的元素检测离子共转运通道的活性通量更高，成本更低，一度成为热门。然而荧光标记物影响细胞，使结果呈现假阴性/假阳性，降低检测精确度。放射性同位素示踪通道蛋白作为另一种新出现的检测方法涉及到放射性污染的问题，并不适合长远发展。选择适当的示踪离子，通过培养后测量胞内和胞外示踪离子的浓度，可有效避免荧光标记物造成的结果误差和潜在使用隐患，同时有效地检验离子转运通道的功能活性。非放射性铷离子大小与钾离子相近，可以进出钾离子通道。加上没有在生物系统中发现，在鉴定过程中可以排除背景干扰，因此在众多与钾离子通道的研究当中被作为示踪离子采用。由于氯离子共转运通道在转运氯离子的同时可以协同运输钠离子和钾离子，铷离子在本专利技术中作为示踪离子研究氯离子共转运通道的活性同样有效。然而细胞实验的微量需求，导致检验设备的灵敏度要求更加严格。综合现有方法与条件，关于研究氯离子共转运通道活性，需要一种简单、省时、高通量、高灵敏度的检测方法。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术提供一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法，通过培养稳定表达特定离子通道的细胞，以非放射性离子作为示踪离子，结合离子通道阅读器的使用，进行氯离子共转运通道的分析。为了实现上述目的，本专利技术采用的一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法，所述离子通道阅读器包括自动移液工作平台、光源、原子化器、光学系统和检测器；所述自动移液工作平台包括能在三维方向自由移动的机械臂、标准溶液放置平台、微孔板放置平台、注射清洗模块、注射泵，所述注射清洗模块包括样品注射入口和清洗槽，且所述样品注射入口和清洗槽各自独立设置在注射清洗模块的两侧；所述样品注射入口与注射泵连接，所述注射泵的一侧设有步进电机，所述注射泵上设有进样针接口和蒸馏水接口；所述光源采用空心阴极灯；所述原子化器包括点火器、石墨炉、切换平台、采用高压火花引导的点火系统和用于调节气体流量的电压控制的比例阀；所述光学系统包括单色器和光栅角度调节装置；所述检测器包括光电倍增管，用于测定进入光谱仪的光的强度；离子转运通道活性分析方法，具体包括以下步骤：1)细胞的培养与相关溶液配置；2)仪器测定细胞裂解液内Rb+浓度及仪器条件；3)标准工作曲线绘制。作为改进，所述光栅角度调节装置包括设定于特定位置的光耦、限位开关一、丝杆和限位开关二；根据测量示踪元素采用的特征波长，在丝杆上放置光耦，当滑块移至设定的光耦处，光耦发出信号。作为改进，所述的细胞的培养与相关溶液配置具体包括以下操作：常规培养表达离子转运通道的细胞株：细胞的培养浓度控制在1.1×107个/20mL，在37℃和5％CO2的湿润条件下培养24小时，使用胰蛋白酶将贴壁细胞消化，未被消化的细胞脱落变成待用细胞悬液，弃其培养基，并接种到96-或384-微板中，用200uL低渗无氯溶液在室温条件下培养60分钟；设立96-微板A和B，分别加入2uL乌本苷，并在低渗培养结束15分钟前，把198uL的溶液从接种细胞的微板转移到微板A，充分混合，再把接种细胞版的溶液置换，加入微板A的全部溶液，培养10分钟；微板B加入198uLRb+内析液和待测药物，待接种细胞版的低渗培养结束后，弃去低渗培养液，再加入微板B的含待测药物的Rb+内析液，培养2分钟，再弃去Rb+内析液，用200uL洗涤缓冲液洗涤细胞株，洗掉残留Rb+，然后加入180uL细胞裂解液，收集200uL细胞裂解液。作为改进，所述的低渗无氯溶液包括sodiumgluconate、potassiumgluconate、HEPES、glucose、MgSO4、CaCl2、Na2HPO4andNaH2PO4。作为改进，所述的Rb+内析液包括NaCl、RbCl、HEPES、glucose、MgSO4、CaCl2、Na2HPO4、和NaH2PO4。作为改进，所述洗涤缓冲液成分包括NaCl、RbCl、HEPES、glucose、MgSO4、CaCl2、Na2HPO4和NaH2PO4；所述的裂解液包括1％NP-40，CAS9016-45-9。作为改进，当检验NKCC1时，常规培养表达NKCC1的细胞株采用HEK细胞株；表达NKCC1的HEK细胞株直至贴壁率为95％。作为改进，所述的仪器测定细胞裂解液内Rb+浓度及仪器条件，具体包括以下操作：a)200uL细胞裂解液用离子通道阅读器测定Rb+内析的浓度，将上述含待测药物的固定缓冲液中的待测药物设定为不同的浓度，重复测定，根据不同浓度的待测药物的测定得到数据；b)基于离子通道阅读器的无荧光标记法分析氯离子共转运通道活性。作为改进，所述的标准工作曲线绘制，具体包括以下操作：根据不同的待测药物浓度和所得的相应数据，以药物浓度为横坐标，相应的抑制％为纵坐标，绘制标准曲线。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1)本专利技术克服了离子共转运通道因电中性无法使用膜片钳检测的困难，同时规避了荧光标记和同位素标记存在的结果误差和安全隐患，为氯离子共转运蛋白的活性检测提供了全新的方法。2)本专利技术的离子通道阅读器实现取样，进样和清洗全自动化，同时采用了微量进样技术，使待检测样品用量达到微升级别，符合细胞实验微量需求。本专利技术构建了稳定的实验系统环境，节省人力物力，减少实验结果误差。3)本专利技术可以检测离子转运通道的活性，从离子转运通道与疾病的关系角度，有助于深入探讨离共转通道缺陷导致结构和功能异常引起的相关疾病(例如肿瘤和神经疾病-癫痫)；继而发展以离子转通道为靶点的药物研发筛选或药物心血管安全性检测和评价。同时，还可以应用到再生医学，利用干细胞诱到细胞再生；或可作用与离子转运通道的相关天然化合物，作为新型中药的开发。附图说明图1为本专利技术离子通道阅读器的结构示意图；图2为本专利技术离子通道阅读器中注射泵的主视图；图3为本专利技术离子通道阅读器中注射泵的左视图；图4为本专利技术离子通道阅读器中光栅角度调节装置的结构示意图；图5为本专利技术离子通道阅读器中原子化器的结构示意图；图6为本专利技术离子通道阅读器中点火器的结构示意图；图中：1、机械臂，2、标准溶液放置平台，3、微孔板放置平台，4、微孔板，5、注射清洗模块，6、步进电机，7、注射泵，8、进样针接口，9、蒸馏水接口，10、光耦，11、限位开关一，12、丝杆，13、限位开关二，14、点火器，15、石墨炉，16、切换平台，17、火焰传感器，18、绝缘垫片，19、乙炔入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法，其特征在于，所述离子通道阅读器包括自动移液工作平台、光源、原子化器、光学系统和检测器；所述自动移液工作平台包括能在三维方向自由移动的机械臂(1)、标准溶液放置平台(2)、微孔板放置平台(3)、注射清洗模块(5)、注射泵(7)，所述注射清洗模块(5)包括样品注射入口和清洗槽，且所述样品注射入口和清洗槽各自独立设置在注射清洗模块(5)的两测；所述样品注射入口与注射泵(7)连接，所述注射泵(7)的一侧设有步进电机(6)，所述注射泵(7)上设有进样针接口(8)和蒸馏水接口(9)；所述光源采用空心阴极灯；所述原子化器包括点火器(14)、石墨炉(15)、切换平台(16)、采用高压火花引导的点火系统和用于调节气体流量的电压控制的比例阀；所述光学系统包括单色器和光栅角度调节装置；所述检测器包括光电倍增管，用于测定进入光谱仪的光的强度；离子转运通道活性分析方法，具体包括以下步骤：1)细胞的培养与相关溶液配置；2)仪器测定细胞裂解液内Rb+浓度及仪器条件；3)标准工作曲线绘制。

【技术特征摘要】
2018.07.11 CN 20181075572451.一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法，其特征在于，所述离子通道阅读器包括自动移液工作平台、光源、原子化器、光学系统和检测器；所述自动移液工作平台包括能在三维方向自由移动的机械臂(1)、标准溶液放置平台(2)、微孔板放置平台(3)、注射清洗模块(5)、注射泵(7)，所述注射清洗模块(5)包括样品注射入口和清洗槽，且所述样品注射入口和清洗槽各自独立设置在注射清洗模块(5)的两测；所述样品注射入口与注射泵(7)连接，所述注射泵(7)的一侧设有步进电机(6)，所述注射泵(7)上设有进样针接口(8)和蒸馏水接口(9)；所述光源采用空心阴极灯；所述原子化器包括点火器(14)、石墨炉(15)、切换平台(16)、采用高压火花引导的点火系统和用于调节气体流量的电压控制的比例阀；所述光学系统包括单色器和光栅角度调节装置；所述检测器包括光电倍增管，用于测定进入光谱仪的光的强度；离子转运通道活性分析方法，具体包括以下步骤：1)细胞的培养与相关溶液配置；2)仪器测定细胞裂解液内Rb+浓度及仪器条件；3)标准工作曲线绘制。2.根据权利要求1所述的一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法，其特征在于，所述光栅角度调节装置包括设定于特定位置的光耦(10)、限位开关一(11)、丝杆(12)和限位开关二(13)；根据测量示踪元素采用的特征波长，在丝杆(12)上放置光耦(10)，当滑块移至设定的光耦(10)处，光耦(10)发出信号。3.根据权利要求1所述的一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法，其特征在于，所述的细胞的培养与相关溶液配置具体包括以下操作：常规培养表达离子转运通道的细胞株：细胞的培养浓度控制在1.1×107个/20mL，在37℃和5％CO2的湿润条件下培养24小时，使用胰蛋白酶将贴壁细胞消化，未被消化的细胞脱落变成待用细胞悬液，弃其培养基，并接种到96-或384-微板中，用200uL低渗无氯溶液在室温条件下培养60分钟；设立96-微板A和B，分别加入2uL乌本苷，并在低渗培养结束15分钟前，把198uL的溶液从接种细胞的微板转移...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁洞泉，谢永臻，李振华，张为，冯甜儿，
申请(专利权)人：佛山市顺德区欧罗拉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44