基于SERS技术检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及农药检测领域，具体而言，涉及一种基于SERS技术检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的方法和试剂盒。所述试剂盒用于检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮中的一种或多种，其包括固相载体以及标记探针；所述固相载体包被有阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的分子印迹聚合物膜；所述标记探针为偶联有人工抗原以及标记分子的金属纳米粒子；所述人工抗原为阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的人工抗原中的一种，且每种标记探针上的标记分子能够使得其彼此在使用SERS技术检测时得以被区分。本发明专利技术将分子印迹技术与拉曼信号放大探针技术联用，建立对三种农药同时检测的检测方法。

Method and kit for detection of atrazine, chlorpyrifos and Triazolone based on SERS

The invention relates to the field of pesticide detection, in particular to a method and a kit for detecting atrazine, chlorpyrifos and Triazolone based on SERS technology. The kit is used to detect one or more of atrazine, chlorpyrifos and triazolone, including a solid phase carrier and a labeling probe; the solid phase carrier is coated with a molecularly imprinted polymer film of atrazine, chlorpyrifos and triazolone; the labeling probe is a metal nanoparticle coupled with an artificial antigen and a labeling molecule; the artificial antigen is atrazine and lethal. One of the artificial antigens of ticks and triazolones, and the marker molecules on each marker probe enable them to be distinguished from each other when detected by SERS. The invention combines molecular imprinting technology with Raman signal amplification probe technology to establish a detection method for simultaneous detection of three pesticides.

【技术实现步骤摘要】
基于SERS技术检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的方法和试剂盒
本专利技术涉及农药检测领域，具体而言，涉及一种基于SERS技术检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的方法和试剂盒。
技术介绍
表面增强拉曼光谱(SERS)技术作为一种新兴的光谱分析技术，由于其具有操作简单、检测速度快等优点，被广泛应用于药物分析、生物分析、环境污染物等领域的检测。近年来，SERS在农药残留的现场快速实时检测方面凸显出了很大的应用价值，已有很多关于SERS检测农药的相关研究报道，但这些检测方法很大程度取决于吸附分子与SERS基底之间的相互作用以及SERS活性基底的表面等离子共振效应。因此，SERS基底的灵敏度、稳定性和均一性等特性是影响农药定性定量检测结果的关键因素，然而目前SERS基底存在着信号稳定性差、重复性低等难以克服的技术瓶颈，导致SERS技术作为定量手段进行样品分析时结果的不准确和不客观，特别是对农产品复杂基质中信号特征较弱的部分农药检测来说更是一个巨大的挑战，单凭依靠开发新型SERS活性基底去提高农药弱特征峰的检测灵敏度仅仅是一个权宜之计，并不能满足提高其分析准确度。因此，研究和开发新的SERS检测分析体系将会是一个解决当前SERS技术困境的新突破。目前，SERS检测分析体系主要是利用纳米活性基底增强作用对目标分子进行直接检测，这种方法除了重复性差、不能准确定量以外，还存在着非特异性吸附干扰大的问题。SERS免疫标记分析技术是近年来快速发展的一种SERS检测新方法，这种方法实现了生物分析技术、纳米技术与SERS检测技术三者的有机结合，其原理是基底上的固相抗体、标记抗体与抗原结合形成“固相抗体-待测抗原-标记抗体”夹心复合物，利用金、银等贵金属纳米粒子的增强作用建立基于免疫竞争的高灵敏检测技术。该方法中SERS的标记技术因信号探针分子包裹金纳米粒子可产生较强的SERS信号，且不存在距离影响SERS信号的问题，无需目标物具有拉曼光谱特征峰,能避免多种不同分子间的谱峰重叠，对农药多残留检测具有一定借鉴意义。但由于SERS在同一界面溶液体系进行小分子物质竞争法检测时非特异性吸附干扰很大，且对于小分子目标物如采用抗原夹心法存在着很大的技术缺陷，该技术仍然无法适用于农药多残留的同步检测。此外，固相抗体的均一性较难控制导致该方法重现性较差。对于一些农药如草甘膦原本由于其本身的拉曼活性较弱和没有可以吸附到SERS基底上的基团，很难通过常规的方法将其检测出来，单凭依靠开发新型SERS活性基底去提高弱特征峰分子的检测灵敏度仅仅是一个权宜之计。因此，研究和开发新的SERS检测分析体系将会是一个新的突破点。SERS标记技术是现代生物标记方法与SERS光谱方法相结合而发展起来的是一种新型的SERS检测方法，因其具有灵敏度高、特异性强、简便快速、不受水影响等特点，特别是SERS信号很少受光致褪色的影响、SERS标记物不会发生自碎灭等优点，逐渐成为近年生物监测方向的一个研究热点。SERS免疫标记技术的研究还处在起步阶段，还存在不少尚待解决的问题。截至目前为止，尚未见SERS免疫标记技术对农药多残留检测的研究报道，其中主要原因是农药物质分子量小，功能基团较少，不适用传统免疫夹心法，特别是对于SERS信号较弱的农药分子需要依赖于标记探针分子灵敏度。鉴于目前SERS免疫标记技术的发展现状，为了实现多种农药小分子物质的同步检测，一方面需要进一步发展SERS的多组分标记技术，筛选合适的不同拉曼特征信号标记分子，制备高灵敏多组分标记探针；另一方面研究SERS免疫标记技术检测模式，克服免疫夹心法对小分子物质结合活性位点少而导致检测灵敏度低的技术缺陷。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的通过合成多种SERS信号标记分子(苯硫酚,联吡啶类,氰基吡啶类等)，采用共价键、静电自组装等重构技术分别制备基于金属纳米球/载体蛋白/目标物构成的三种不同信号标记探针，实现SERS信号放大检测多组分农药的快速检测。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种基于SERS技术的农药检测试剂盒，所述试剂盒用于检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮中的一种或多种，其包括固相载体以及标记探针；所述固相载体包被有阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的分子印迹聚合物膜；所述标记探针为偶联有人工抗原以及标记分子的金属纳米粒子；所述人工抗原为阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的人工抗原中的一种，且每种标记探针上的标记分子能够使得其彼此在使用SERS技术检测时得以被区分。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及使用如上所述试剂盒检测农药的方法，所述方法用于检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮中的一种或多种，所述方法包括：使用待检测物与所述标记探针竞争性地与所述固相载体结合，并用拉曼激光探头读取所述标记探针的吸光度值以确定所述待检测物中农药的含量。本专利技术基于表面等离子信号增强机理与结构类似物竞争识别理论，通过多组分标记探针信号多重放大技术与分子印迹高效识别技术机理，构建SERS信号放大的高灵敏同步定性定量检测体系，拓展农药多残留快速检测技术的新方法和新途径，为SERS高通量实时快速检测提供理论依据和技术支撑，并用于测定样品(例如蔬菜与水果，如甘蓝和苹果)中的三唑磷、草甘膦、阿特拉津。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供的三唑磷、阿特拉津、毒死蜱识别膜材料具有较高的选择性，可以代替生物抗体应用于拉曼探针的竞争检测技术；该材料由化学方法制备，具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力，克服了传统生物抗体制备周期长、易失活、成本高等缺点。(2)本专利技术将分子印迹技术与拉曼信号放大探针技术联用，建立对三种农药同时检测的检测方法。该方法的最低检出限分别为三唑磷为0.10μgL-1；阿特拉津为0.20μgL-1；毒死蜱为0.10μgL-1；大大低于最高残留限量值，能够满足检测需要，适用于快速检测。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术的原理示意图。具体实施方式本专利技术涉及一种基于SERS技术的农药检测试剂盒，所述试剂盒用于检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮中的一种或多种，其包括固相载体以及标记探针；所述固相载体包被有阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的分子印迹聚合物膜；所述标记探针为偶联有人工抗原以及标记分子的金属纳米粒子；所述人工抗原为阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的人工抗原中的一种，且每种标记探针上的标记分子能够使得其彼此在使用SERS技术检测时得以被区分。在一些实施方式中，所述分子印迹聚合物膜的制备在所述固相载体中进行，其方法包括：将模板分子阿特拉津、毒死蜱、三唑酮溶解于有机溶剂中，与甲基丙烯酸(MAA)进行预反应；随后预反应产物在有机溶剂中与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)，偶氮二异丁腈(AIBN)接触反应；洗脱模板分子后即得所述分子印迹聚合物膜。在一些实施方式中，每种所述模板分子与所述甲基丙烯酸的摩尔比均为1：(5～7)；也可以选择1：6。在一些实施方式中，每种所述模本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于SERS技术的农药检测试剂盒，所述试剂盒用于检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮中的一种或多种，其包括固相载体以及三种标记探针；所述固相载体包被有阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的分子印迹聚合物膜；所述标记探针为偶联有人工抗原以及标记分子的金属纳米粒子；所述人工抗原为阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的人工抗原中的一种，且每种标记探针上的标记分子能够使得其彼此在使用SERS技术检测时得以被区分。

【技术特征摘要】
1.一种基于SERS技术的农药检测试剂盒，所述试剂盒用于检测阿特拉津、毒死蜱、三唑酮中的一种或多种，其包括固相载体以及三种标记探针；所述固相载体包被有阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的分子印迹聚合物膜；所述标记探针为偶联有人工抗原以及标记分子的金属纳米粒子；所述人工抗原为阿特拉津、毒死蜱、三唑酮的人工抗原中的一种，且每种标记探针上的标记分子能够使得其彼此在使用SERS技术检测时得以被区分。2.根据权利要求1所述的农药检测试剂盒，其特征在于，所述分子印迹聚合物膜的制备在所述固相载体中进行，其方法包括：将模板分子阿特拉津、毒死蜱、三唑酮溶解于有机溶剂中，与甲基丙烯酸进行预反应；随后预反应产物在有机溶剂中与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，偶氮二异丁腈接触反应；洗脱模板分子后即得所述分子印迹聚合物膜。3.根据权利要求2所述的农药检测试剂盒，其特征在于，每种所述模板分子与所述甲基丙烯酸的摩尔比均为1：(5～7)；优选的，所述模板分子的浓度均为1.5～2.5mmol。4.根据权利要求2所述的农药检测试剂盒，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈。5.根据权利要求1所述的农药检测试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：佘永新，颜朦朦，王静，王淼，王珊珊，郑鹭飞，曹振，邵勇，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11