基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用于外泌体的检测制造技术

本发明专利技术公开一种基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用于外泌体的检测，涉及稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针的传感器，通过携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链，能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA间的距离拉近到小于10 nm，从而发生荧光共振能量转移，产生荧光信号；该传感器的优点：稀土掺杂的上转换发光纳米材料由于其独特的反斯托克斯发光性能，具有光化学稳定性，无自体荧光；避免使用蛋白等昂贵的试剂、简化了实验流程；该方法基于荧光能量共振转移原理检测具有高灵敏度。可用于乳腺癌细胞来源外泌体的高灵敏检测。

Fluorescence energy resonance transfer based on Upconversion nanomaterials and tetramethylrhodamine for exosome detection

The invention discloses a fluorescence energy resonance transfer method based on up-conversion nanomaterials and tetramethylrhodamine for exosome detection, involving a sensor doped with rare earth up-conversion nanomaterials as fluorescent probes. By carrying two different DNA chains of EpCAM protein adapters of UCNPs and TAMRA, the EpCAM protein on the surface of exosome can be recognized and bound to the protein to form a hairpin. The sensor has the following advantages: rare earth doped up-conversion luminescent nanomaterials have photochemistry stability and no self-fluorescence due to their unique anti-Stokes luminescent properties; avoiding expensive reagents such as proteins and simplifying the experimental process; The method has high sensitivity based on the principle of fluorescence energy resonance transfer. It can be used to detect exosomes from breast cancer cells with high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用于外泌体的检测
本专利技术涉及一种基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明之间的荧光共振能量转移原理的分析方法，属于分析化学及纳米
本专利技术涉及以稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针的适配体传感器，并通过上转换荧光强弱的变化，来实现对外泌体(exosome)的高灵敏检测，属于传感器领域。
技术介绍
外泌体是由多种活细胞分泌的囊泡小体，可以被绝大多数类型的细胞如：B细胞，T细胞，树突细胞，巨噬细胞，神经元，神经胶质细胞，肿瘤细胞和干细胞等分泌产生，直径约为30～100nm。外泌体来源多样并且携带大量的蛋白质、脂质、DNA、RNA等生物信息分子，这使其成为细胞间信息传递或改变的使者。大量与外泌体有关的报道都表明，研究外泌体对生物及医学领域具有重大意义。尤其重要的是，外泌体含有丰富的内容物，是提供癌症诊断、发展、转移等信息的潜在来源。因此，外泌体的分析检测在研究中显得尤为重要。外泌体定量常用的方法主要是利用动态光散射仪(DLS)、纳米粒子示踪技术(NTA)；外泌体的定性分析主要是依赖其表面蛋白进行的，常用的检测方法有流式细胞术(FlowCytometry)、蛋白质印迹法(WesternBlot)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等。这些方法虽然经典，却有着仪器昂贵、分析耗时、所需样品量大等缺点。因此，开发一种高灵敏度、便捷快速的外泌体检测方法显得尤为重要。最近，多位学者利用核酸适配体的方法对外泌体进行了检测。核酸适配体是一条可以与配体特异性结合的DNA或RNA单链。Qing等人利用外泌体表面蛋白CD63的适配体研制出一种电化学传感器，对外泌体进行了检测，检测限(LOD)为1×106particles/mL；Xia等人应用纳米材料碳管设计了一种可视化的适配体生物传感器用于外泌体检测，检测限低达5.2×105particles/μL；Chen应用上转换纳米材料设计了一种基于荧光共振能量转移的纸基技术用于外泌体检测，检测限可低至1.1×103particles/μL。以上技术提供了一种检测外泌体的新思路。稀土掺杂的上转换发光纳米材料由于其独特的反斯托克斯发光性能在生物应用中具有较大优势，被广泛应用于生物领域。荧光共振能量转移(LRET)是一种无辐射过程，即处于激发态的能量供体将能量无辐射的转移给能量受体，后者通过荧光发射或其它无辐射方式将能量释放出来。产生荧光共振能量转移的前提是能量供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠且二者的空间距离在10nm之内，因此LRET技术具有灵敏度高、分辨率高、简单方便等优点。UCNPs具有良好的化学稳定性、光稳定性、无自体荧光等优点，是一种较好的进行LRET的能量供体。基于LRET原理，使用UCNPs构建荧光生物传感器用于生物检测或光动力治疗、光学成像等应用正成为研究热点。四甲基罗丹明(TAMRA)是一种可见光区荧光染料，它的荧光激发光谱与NaYF4:Yb,Er的发射光谱具有较大重叠，且其发射峰位于585nm，恰好与NaYF4:Yb,Er的发射峰分离，因此在NaYF4:Yb,Er作为能量供体进行能量共振转移时，TAMRA是一个很好的能量受体。受上述研究启发，我们设计了一种基于荧光共振能量转移原理检测外泌体的方法。先将EpCAM蛋白的DNA适配体分割成两条DNA链，分别将UCNPs和TAMRA修饰在两条链的末端。当检测外泌体时，由于外泌体表面EpCAM蛋白的存在，使两条DNA链靠近，从而拉近了UCNPs与TAMRA间的距离，使UCNPs的荧光发生猝灭，利用上转换荧光强弱的变化，来实现对外泌体的高灵敏检测。本方法有望实现一种简单、经济、高选择性、高灵敏度检测外泌体的新型生物传感技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于设计了一种基于荧光共振能量转移原理检测外泌体的方法，利用上转换荧光强弱的变化，来实现对外泌体的高灵敏检测。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器，其特征在于：包括UCNPs、TAMRA修饰的EpCAM-2和UCNPs修饰的EpCAM-1(DNA)，所述的EpCAM-1的DNA序列为：5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGT-3’,5’端修饰-COOH；EpCAM-2的碱基序列为：5’-CCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’,3’端修饰TAMRA；携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链(EpCAM-1-UCNPs，EpCAM-2-TAMRA)，能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA之间的距离拉近到小于10nm，从而发生荧光共振能量转移，当在980nm近红外光激发下，TAMRA会发出黄色荧光，利用585nm处荧光强弱的变化，能进行溶液中外泌体的定量分析。本专利技术所述的用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)稀土掺杂上转换纳米材料的合成：加含量是Y78％，Yb20％，Er2％的稀土硬脂酸盐0.8mmol，NaF28mmol，油酸(OA)12mL，十八烯(ODE)8mL于100mL三颈烧瓶，氩气氛围中回流加热至135℃～145℃，保持30min进行脱水脱气；然后迅速升温至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000rpm离心3min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥，获得油酸包覆的UCNPs；2)BF4-修饰UCNPs：称取10mg步骤1)制得的油酸包覆的UCNPs，超声分散在2mL环己烷中，加入2mLNOBF4的DMF溶液，轻轻摇动10min，静置分层，将上方己烷层除去，加入体积比为1:1的甲苯和环己烷混合溶剂共2mL纯化，离心11000r/min，5min，DMF洗一次，沉淀烘干备用；3)EpCAM-1修饰UCNPs：取1mg/mL步骤2)制得的BF4--UCNPs的水溶液500μL，加入至小玻璃瓶中，加入1.5nmol的EpCAM-1，加纯水使最终体积为1mL，UCNPs修饰的EpCAM-1的EpCAM-1-UCNPs最终浓度为1.5μM，4℃搅拌过夜，8000r/min超滤离心5min，沉淀水洗两次，重分散在500μL纯水中，4℃保存备用；4)5ml的EP管中分别加入5μL步骤3)制得的浓度为1.5μMEpCAM-1-UCNPs、0.25μM的EpCAM-2-TAMRA最后加配比为Tris-HCl10mM,NaCl100mM的Tris盐酸缓冲液配置成100μL溶液，28℃振荡1h，检测其荧光强度，即得荧光传感器，用于检测其荧光强度。所述的BF4-修饰UCNPs的制备：1)含量为Y78％，Yb20％，Er2％的稀土硬脂酸盐的制备：将稀土硝酸盐乙醇溶液与浓度为284.48g/mol的硬脂酸(十八酸)17.0688g(60mmol)加入到250mL三颈烧瓶中；70℃加热回流至液体澄清，逐滴加入119g/L的NaOH溶液，10mL左右，调节溶液pH至5～6之间；滴加完后升温至78℃继续回流搅拌30min；冷却至室温后减压抽滤，水洗2次后再用乙醇洗涤2次；所得的滤饼转移至烘箱中，60℃条件下干燥12h，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器，其特征在于：包括UCNPs、TAMRA 修饰的EpCAM‑2和UCNPs修饰的EpCAM‑1（DNA），所述的EpCAM‑1的DNA序列为：5’‑CACTACAGAGGTTGCGTCTGT‑3’, 5’端修饰‑COOH；EpCAM‑2的碱基序列为： 5’‑CCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG‑3’, 3’ 端修饰TAMRA；携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链（EpCAM‑1‑UCNPs，EpCAM‑2‑TAMRA），能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA之间的距离拉近到小于10 nm，从而发生荧光共振能量转移，当在980 nm近红外光激发下，TAMRA会发出黄色荧光，利用585 nm处荧光强弱的变化，能进行溶液中外泌体的定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器，其特征在于：包括UCNPs、TAMRA修饰的EpCAM-2和UCNPs修饰的EpCAM-1（DNA），所述的EpCAM-1的DNA序列为：5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGT-3’,5’端修饰-COOH；EpCAM-2的碱基序列为：5’-CCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’,3’端修饰TAMRA；携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链（EpCAM-1-UCNPs，EpCAM-2-TAMRA），能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA之间的距离拉近到小于10nm，从而发生荧光共振能量转移，当在980nm近红外光激发下，TAMRA会发出黄色荧光，利用585nm处荧光强弱的变化，能进行溶液中外泌体的定量分析。2.一种制备如权利要求1所述的用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）稀土掺杂上转换纳米材料的合成：加含量是Y78%，Yb20%，Er2%的稀土硬脂酸盐0.8mmol，NaF28mmol，油酸（OA）12mL，十八烯（ODE）8mL于100mL三颈烧瓶，氩气氛围中回流加热至135℃~145℃，保持30min进行脱水脱气；然后迅速升温至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000rpm离心3min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥，获得油酸包覆的UCNPs；2）BF4-修饰UCNPs：称取10mg步骤1）制得的油酸包覆的UCNPs，超声分散在2mL环己烷中，加入2mLNOBF4的DMF溶液，轻轻摇动10min，静置分层，将上方己烷层除去，加入体积比为1:1的甲苯和环己烷混合溶剂共2mL纯化，离心11000r/min，5min，DMF洗一次，沉淀烘干备用；3）EpCAM-1修饰UCNPs：取1mg/mL步骤2）制得的BF4--UCNPs的水溶液500μL，加入至小玻璃瓶中，加入1.5nmol的EpCAM-1，加纯水使最终体积为1mL，UCNPs修饰的EpCAM-1的EpCAM-1-UCNPs最终浓度为1.5μM，4℃搅拌过夜，8000r/min超滤离心5min，沉淀水洗两次，重分散在500μL纯水中，4℃保存备用；4）5ml的EP管中分别加入5μL步骤3）制得的浓度为1.5μMEpCAM-1-UCNPs、0.25μM的EpCAM-2-TAMRA最后加配比为Tris-HCl10mM,NaCl100mM的Tris盐酸缓冲液配置成1...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰建明，陈敬华，李春艳，吴芳，罗登旺，方垚，盛依伦，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35