一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种自适应扫描宽视场高通量层析成像方法及装置，属于显微成像技术领域。本方法利用超短脉冲激光，通过时空聚焦与扫描相结合的方法，将样品的目标成像区域划分为若干个子区域，采用时分复用方法将各子区域进行快速自适应扫描，并进行同步数据采集，将采集的各子区域的显微图像重建及数据处理后得到一个扫描周期内的目标扫描区域三维空间信息，最后通过三维空间扫描与延时扫描获取样品(x,y,z,t)四维信息。本发明专利技术装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、结合时空聚焦技术的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统及图像重建与数据处理系统。本发明专利技术具有宽视场、高通量、低激发功率、高信噪比等优点。

An Adaptive Scanning Wide Field of View High Flux Tomography Microscopic Imaging Method and Device

The invention discloses an adaptive scanning wide field of view high flux tomography method and device, which belongs to the field of microscopic imaging technology. This method divides the target imaging region into several sub-regions by using ultra-short pulse laser and combining time-space focusing with scanning. Time-division multiplexing method is used to scan each sub-region rapidly and adaptively, and synchronously collect data. The micro-images of each sub-region are reconstructed and processed to obtain the target scanning in a scanning cycle. Finally, four-dimensional information of samples (x, y, z, t) is obtained by three-dimensional spatial scanning and time-lapse scanning. The device comprises an ultrashort pulse laser source and a beam transformation system, a sub-area scanning system combined with space-time focusing technology, an optical microscopy and filtering system, a synchronous microscopic imaging system and an image reconstruction and data processing system. The invention has the advantages of wide field of view, high flux, low excitation power and high signal-to-noise ratio.

【技术实现步骤摘要】
一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置
本专利技术涉及一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置，属于显微成像

技术介绍
系统生物学研究，尤其是生物动态过程研究，通常需要进行大尺度、高时空分辨率的观测。例如，在脑科学中，为了研究神经冲动在神经网络中的传递和变换(如跨脑区的神经活动等)；在免疫学、肿瘤学中，为了研究免疫细胞或肿瘤细胞的转移或迁徙等，均需要进行大尺度、高分辨率、高速、高通量的在体原位观测。然而商用显微镜系统的物镜存在着大视场与高分辨率之间的固有矛盾。为此，人们最近提出了几种中尺度物镜(Mesoscope)的新型设计，将物镜视场提高到亚厘米级水平。但遗憾的是，限于所采用的显微成像方案，这些宽视场显微系统并未实现高分辨率、高速、高通量成像。原因在于：为了满足活体散射组织成像的迫切需求，现有的宽视场显微系统大多基于激光扫描共聚焦技术，以利用其具备层析能力且一定程度上可克服散射的优势，但对于点扫描方式，提升成像速度及数据通量均受到极大挑战。例如，在基于中尺度透镜的双光子宽视场显微成像中(eLife5,e14472(2016))，尽管该显微系统视场直径宽达5毫米，但是由于采用点扫描成像技术，该系统的数据通量仅为10.66M像素/秒，完整视场的成像帧率为0.7帧/秒，这显然无法发挥宽视场高分辨显微系统的优势。因此，如何在确保具备三维层析、深穿透能力的同时，突破点扫描成像技术在速度及数据通量方面的局限成为当前的一大挑战。最近，人们提出了一种宽视场层析成像方法——时空聚焦技术，即在时域、空域两个维度对激发光脉冲进行聚焦，从而实现宽场层析激发。具体方法是，首先采用色散器件对光脉冲在时间上展宽，使不同频率的光能量分散开，之后通过准直透镜和物镜将展宽的光脉冲重新在聚焦面上会聚，从而实现基于非线性光学效应的宽场层析激发。与多光子点扫描技术不同，时空聚焦显微实现了一定面积区域的并行激发，从而提高了成像速度及数据通量，且保留了层析能力。但是对于宽视场层析成像，所需激发功率通常过高，甚至远远超过生物组织的安全激发功率(约为200mW@920nm)。目前采用时空聚焦技术，已报道的最大面激发区域约为0.1mm2，所采用的激发器输出功率为4W(OpticalExpress20(8),8939(2012))。对于超宽视场层析成像，随着激发区域面积的增大，所需的激发光功率呈二次指数增长。具体解释如下：采用时空聚焦技术对面积分别为A1、A2(A1>A2)的区域进行双光子激发，采用相同的激光脉冲参数及聚焦条件的情况下，欲保证相同的激发效率，所需激发光功率的比值为(A1/A2)2。以上述目前报道的最大宽视场层析激发案例做参考，欲实现直径5mm视场的并行激发，所需激光功率将远远大于生物组织的安全激发功率。这无疑对超宽视场层析成像技术提出了一大挑战。此外，在实际的宽视场层析成像中，有时目标成像区域并非涵盖全视场，而是视场中离散的几个子区域。而常规技术通常对视场中的全部信息进行层析成像，此时无疑浪费了有限的数据通量。因此，目前需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够创新地提出一种有效措施，以解决现有技术中存在的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服已有技术的不足之处，提出一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置，本专利技术克服了在增大成像视场时需要极大增加激发光功率的挑战，并可实现数据通量的有效利用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提出的一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，并设定沿x轴、y轴和z轴的扫描路径，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，根据所述目标扫描区域的大小设定扫描周期和扫描总时长；2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法引入角色散并通过扫描引入可变偏转角，经光学显微后在空间及时间两个维度进行聚焦，形成N个相应面积的层析聚焦区并激发荧光信号，一个所述层析聚焦区记为一个子区域，得到各个子区域的三维信息(xi,yi,,zi)，i＝1,2,…N；4)通过非线性光学效应在步骤3)中产生的荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，再次经过所述光学显微后由滤波片滤除反向传输的激发光；然后由面阵探测器进行荧光信号采集，得到各子区域显微图像，其中，通过时分复用方法使所述面阵探测器的探测周期与步骤3)所用时间同步；5)根据预设的扫描路径同步改变扫描的偏转角和改变聚焦的深度，直至扫描遍历所述目标扫描区域XYZ，完成不同深度荧光信号的获取，则一次三维扫描完成；其中，对各个子区域的扫描方式采用连续子区域逐个扫描或任意离散子区域随机扫描；6)将经步骤5)获得的所有子区域显微图像分别进行图像校正，对校正后的子区域显微图像进行图像重建与数据处理，得到当前扫描周期下目标扫描区域的三维空间信息(x,y,z)，当前扫描周期结束；7)根据设定的扫描周期重复步骤3)～步骤6)进行延时三维显微成像，获得(x,y,z,t)四维时空信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场高通量层析显微成像。本专利技术还提出一种根据上述自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法的装置，其特征在于，该装置包括：超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统、以及图像重建与数据处理系统；其中，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整所述激发脉冲光光束尺寸；所述基于时空聚焦的子区域扫描系统，置于所述光束变换系统之后，包括透镜、光学衍射元件、若干个光学扫描元件以及位于若干个光学扫描元件之间使各光学扫描元件光学共轭的透镜组，且所述光学衍射元件及光学扫描元件分别置于所述透镜的物方焦面与像方焦面；通过所述光学衍射元件产生的时空色散作用引入激发脉冲光束的角色散；通过所述光学扫描元件引入不同方向的可变偏转角并形成与各偏转角对应的子区域，同时激发荧光信号；所述光学显微及滤波系统，包括光学显微系统和滤波系统；所述光学显微系统置于所述光学扫描元件之后，该光学显微系统包括透镜组和显微物镜，由该透镜组连接所述光学扫描元件及所述显微物镜后入瞳面，并构成4f系统，用于激发光束的色散引入和重聚焦、并探测荧光信号；所述滤波系统包括多个滤波片，置于荧光信号的探测光路中，用于滤除入射的激发光信号；所述同步显微成像系统，置于所述荧光信号的探测光路的末端，包括透镜和成像器件，用于荧光信号的采集；所述图像重建与数据处理系统，与所述基于时空聚焦的子区域扫描系统中的各光学扫描元件和所述同步显微成像系统中的成像器件相连，用于对成像器件采集到的各子区域扫描图像进行全局图像拼接，并通过时分复用方法控制成像器件获取的随时间变化的荧光引起的探测器上的电信号与各子区域扫描信号总时长同步。与现有技术相比，本专利技术具有显著优势：通过结合时空聚焦技术，根据目标成像区域的需要，采用时分复用(TimeDivisionMultiplexing,TDM)方法将各子区域进行快速自适应扫描(包含逐个扫描或随机扫描)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，并设定沿x轴、y轴和z轴的扫描路径，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，根据所述目标扫描区域的大小设定扫描周期和扫描总时长；2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法引入角色散并通过扫描引入可变偏转角，经光学显微后在空间及时间两个维度进行聚焦，形成N个相应面积的层析聚焦区并激发荧光信号，一个所述层析聚焦区记为一个子区域，得到各个子区域的三维信息(xi,yi,,zi)，i＝1,2,…N；4)通过非线性光学效应在步骤3)中产生的荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，再次经过所述光学显微后由滤波片滤除反向传输的激发光；然后由面阵探测器进行荧光信号采集，得到各子区域显微图像，其中，通过时分复用方法使所述面阵探测器的探测周期与步骤3)所用时间同步；5)根据预设的扫描路径同步改变扫描的偏转角和改变聚焦的深度，直至扫描遍历所述目标扫描区域XYZ，完成不同深度荧光信号的获取，则一次三维扫描完成；其中，对各个子区域的扫描方式采用连续子区域逐个扫描或任意离散子区域随机扫描；6)将经步骤5)获得的所有子区域显微图像分别进行图像校正，对校正后的子区域显微图像进行图像重建与数据处理，得到当前扫描周期下目标扫描区域的三维空间信息(x,y,z)，当前扫描周期结束；7)根据设定的扫描周期重复步骤3)～步骤6)进行延时三维显微成像，获得(x,y,z,t)四维时空信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场高通量层析显微成像。...

【技术特征摘要】
1.一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，并设定沿x轴、y轴和z轴的扫描路径，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，根据所述目标扫描区域的大小设定扫描周期和扫描总时长；2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法引入角色散并通过扫描引入可变偏转角，经光学显微后在空间及时间两个维度进行聚焦，形成N个相应面积的层析聚焦区并激发荧光信号，一个所述层析聚焦区记为一个子区域，得到各个子区域的三维信息(xi,yi,,zi)，i＝1,2,…N；4)通过非线性光学效应在步骤3)中产生的荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，再次经过所述光学显微后由滤波片滤除反向传输的激发光；然后由面阵探测器进行荧光信号采集，得到各子区域显微图像，其中，通过时分复用方法使所述面阵探测器的探测周期与步骤3)所用时间同步；5)根据预设的扫描路径同步改变扫描的偏转角和改变聚焦的深度，直至扫描遍历所述目标扫描区域XYZ，完成不同深度荧光信号的获取，则一次三维扫描完成；其中，对各个子区域的扫描方式采用连续子区域逐个扫描或任意离散子区域随机扫描；6)将经步骤5)获得的所有子区域显微图像分别进行图像校正，对校正后的子区域显微图像进行图像重建与数据处理，得到当前扫描周期下目标扫描区域的三维空间信息(x,y,z)，当前扫描周期结束；7)根据设定的扫描周期重复步骤3)～步骤6)进行延时三维显微成像，获得(x,y,z,t)四维时空信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场高通量层析显微成像。2.一种根据权利要求1所述自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法的装置，其特征在于，该装置包括：超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统、以及图像重建与数据处理系统；其中，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整所述激发脉冲光光束尺寸；所述基于时空聚焦的子区域扫描系统，置于所述光束变换系统之后，包括透镜、光学衍射元件、若干个光学扫描元件以及位于若干个光学扫描元件之间使各光学扫描元件光学共轭的透镜组，且所述光学衍射元件及光学扫描元件分别置于...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令杰，谢浩，张元龙，戴琼海，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11