一种5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-三唑与血清作用的差异蛋白检测方法技术

本发明专利技术涉及一种5‑苯基‑1‑(对甲基苯基)‑1H‑三唑与血清作用的差异蛋白检测方法，包括：将血清样品与5‑苯基‑1‑(对甲基苯基)‑1H‑1,2,3‑三唑化合物混合；除去高丰度蛋白；Bradford法定量测定蛋白浓度；进行双向电泳实验；胶片图像处理及质谱鉴定等步骤。本发明专利技术还提供一种5‑苯基‑1‑(对甲基苯基)‑1H‑三唑的制备方法。

A Differential Protein Detection Method for the Interaction of 5-Phenyl-1-(p-methylphenyl)-1H-triazole with Serum

The present invention relates to a differential protein detection method for the interaction of 5 phenyl (p-methyl phenyl)1H triazole with serum, including the following steps: mixing serum samples with 5 phenyl (p-methyl phenyl)1H 1, 2, 3 triazole compounds; removing high abundance proteins; measuring protein concentration by Bradford method; conducting two-dimensional electrophoresis experiments; film image processing and mass spectrometry identification. The invention also provides a preparation method of 5 phenyl 1 (p-methylphenyl) 1H triazole.

【技术实现步骤摘要】
一种5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-三唑与血清作用的差异蛋白检测方法
本专利技术属于有机合成及生物化学领域，具体涉及一种5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-三唑与血清作用的差异蛋白检测方法。
技术介绍
1,2,3-三氮唑化合物以其独特的五元芳香含氮杂环结构，可与其他取代基相缀合或并合形成多种类型具有药物活性的衍生物，又表现出低毒性及良好的生物活性，已在材料化学、药物化学、有机化学和有机金属化学等许多领域有广泛的应用，并愈来愈受到研究者的青睐。而蛋白质组学是一门在蛋白质水平上认识生命机理的学科，其学术理念和相关技术方法已被广泛应用于生命科学的各个领域，涉及多种重要的生物学现象，并已成为人类重大疾病诊断、治疗和寻找药物靶点的有效方法之一。小分子药物的作用靶点通常是蛋白质，而蛋白质组学是一种应用化学小分子来检测整个目标蛋白质组的手段，从整体水平上，观察蛋白质组的变化，发现差异表达蛋白并研究它的的生物功能以及与小分子的作用机理，从而找到新的药物靶点或者发现具有药用价值的小分子。人体血液中的蛋白质几乎与机体中所有的细胞、组织、器官有关，血液蛋白的动态变化可以直接反应机体的健康情况，是研究各类疾病相关标志物最有价值的标本。本专利技术化合物5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑通过在模拟人生理温度条件下，进行血清与化合物相互结合的体外培养，并采用蛋白质组学研究方法结合MALDI-TOF-MS技术开展在化合物存在时的血清蛋白质组学研究，分析差异表达蛋白，寻找特定疾病的特异血清蛋白标志物或者发现新的疾病相关蛋白质，为疾病的诊断或治疗提供新的依据，为5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑可能作为新药物的开发提供更加直观的理论基础。
技术实现思路
本专利技术提供一种5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑与血清作用检测差异蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将血清蛋白与5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物溶液混合均匀得样品a，恒温培养得样品b；(2)去除样品b中的高丰度蛋白得样品c(3)用Bradford法对样品c的蛋白浓度进行定量。(4)进行双向电泳实验：①按每胶条蛋白质上样量1.3mg，上样总体积为455uL的标准水化上样，进行第一向等电聚焦；②第一向等电聚焦完毕后，将胶条平衡后转到聚丙烯酰胺凝胶进行第二垂直电泳实验；③电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色，保存，扫描分析；(5)胶片图像处理及质谱鉴定①凝胶图像分析，筛选出表达异常的蛋白点并做上标记；②差异蛋白点的酶解及质谱鉴定；(6)结果利用ImageMaster5.0凝胶图像分析软件获得20个差异表达蛋白质点，再通过NCBInr的Blast的检索，确定了其中1-16、18-20号差异表达蛋白的信息(见下表)。所述步骤(1)中5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物溶液为5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物的甲醇溶液，样品a中5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物的浓度为2.0×10-3mol/L；恒温培养：温度为37℃，转速为r＝280rpm，时间为1h；所述血清蛋白优选人血清蛋白；所述步骤(2)中去除高丰度蛋白的方法优选按照AndyBio试剂盒要求去除高丰度蛋白；所述步骤(4)中胶条规格为24cm非线性IPG胶条IPGpH＝3～10NL。本专利技术的另一实施方案提供5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑在与血清蛋白作用确定差异蛋白中的应用。本专利技术的另一实施方案提供一种制备5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑的方法，其特征在于包括如下步骤：室温下，将1-叠氮基-4-甲基苯与苯乙烯溶于有机溶剂中，加入SmI2，搅拌反应2小时后得到5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑；所述有机溶剂为THF与HMPA体积比为1:1的混合溶液；1-叠氮基-4-甲基苯、苯乙烯、SmI2的摩尔比为1：1.0-1.2：2.0。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术建立了5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物与人血清作用的差异蛋白检测的双向电泳研究方法，优点是样品处理时间短，操作简单，获得的图谱清晰，重复性好；共获得20个差异表达蛋白，并成功鉴定了19个，对进一步了解5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑作为活性化合物小分子参与转运和代谢过程中相关的血液蛋白信息及相关的代谢网络，及更为深入研究开发及利用5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑奠定科学合理的理论基础；(2)本专利技术提供了一种以SmI2催化1-叠氮基-4-甲基苯与苯乙烯制备5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑的全新方法，该方法操作简便，收率高。附图说明图1为5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑的结构图；图2为人血清样品双向电泳图谱；图3为人血清样品与5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物相互作用的双向电泳图谱；图4为1号蛋白一级质谱图；图5为1号蛋白肽段分子量为1994.1335(+1)的二级图谱；图6为2号蛋白一级质谱图；图7为2号蛋白肽段分子量为1478.7638(+1)的二级图谱；图8为3号蛋白一级质谱图；图9为3号蛋白肽段分子量为1546.6819(+1)的二级图谱；图10为4号蛋白一级质谱图；图11为4号蛋白肽段分子量为2680.5447(+1)的二级图谱；图12为5号蛋白一级质谱图；图13为5号蛋白肽段分子量为1773.8827(+1)的二级图谱；图14为6号蛋白一级质谱图；图15为6号蛋白肽段分子量为2186.1663(+1)的二级图谱；图16为7号蛋白一级质谱图；图17为7号蛋白肽段分子量为1646.9363(+1)的二级图谱；图18为9号蛋白一级质谱图；图19为9号蛋白肽段分子量为2296.2661(+1)的二级图谱；图20为10号蛋白一级质谱图；图21为10号蛋白肽段分子量为2296.2036(+1)的二级图谱；图22为11号蛋白一级质谱图；图23为11号蛋白肽段分子量为1874.9916(+1)的二级图谱；图24为12号蛋白一级质谱图；图25为12号蛋白蛋白肽段分子量为1389.8960的二级图谱；图26为13号蛋白一级质谱图；图27为13号蛋白蛋白肽段分子量为1902.0244的二级图谱；图28为14号蛋白一级质谱图；图29为14号蛋白蛋白肽段分子量为980.54681的二级图谱；图30为15号蛋白一级质谱图；图31为15号蛋白肽段分子量为1215.8031的二级图谱；图32为16号蛋白一级质谱图；图33为16号蛋白蛋白肽段分子量为2730.6677的二级图谱；图34为18号蛋白一级质谱图；图35为18号蛋白蛋白肽段分子量为1406.7456的二级图谱；图36为19号蛋白一级质谱图；图37为19号蛋白肽段分子量为1311.8309的二级图谱；图38为20号蛋白一级质谱图；图39为20号蛋白肽段分子量为1716.9952的二级图谱。具体实施方式为了便于对本专利技术的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解专利技术而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种5‑苯基‑1‑(对甲基苯基)‑1H‑1,2,3‑三唑与血清作用检测差异蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将血清蛋白与5‑苯基‑1‑(对甲基苯基)‑1H‑1,2,3‑三唑化合物溶液混合均匀得样品a，恒温培养得样品b；(2)去除样品b中的高丰度蛋白得样品c；(3)用Bradford法对样品c的蛋白浓度进行定量；(4)进行双向电泳实验①按每胶条蛋白质上样量1.3mg，上样总体积为455uL的标准水化上样，进行第一向等电聚焦；②第一向等电聚焦完毕后，将胶条平衡后转到聚丙烯酰胺凝胶进行第二垂直电泳实验；③电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色，保存，扫描分析；(5)胶片图像处理及质谱鉴定①凝胶图像分析，筛选出表达异常的蛋白点并做上标记；②差异蛋白点的酶解及质谱鉴定；(6)结果利用ImageMaster5.0凝胶图像分析软件获得20个差异表达蛋白质点，再通过NCBInr的Blast的检索，确定了其中1‑16、18‑20号差异表达蛋白的信息见下表，

【技术特征摘要】
1.一种5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑与血清作用检测差异蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将血清蛋白与5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物溶液混合均匀得样品a，恒温培养得样品b；(2)去除样品b中的高丰度蛋白得样品c；(3)用Bradford法对样品c的蛋白浓度进行定量；(4)进行双向电泳实验①按每胶条蛋白质上样量1.3mg，上样总体积为455uL的标准水化上样，进行第一向等电聚焦；②第一向等电聚焦完毕后，将胶条平衡后转到聚丙烯酰胺凝胶进行第二垂直电泳实验；③电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色，保存，扫描分析；(5)胶片图像处理及质谱鉴定①凝胶图像分析，筛选出表达异常的蛋白点并做上标记；②差异蛋白点的酶解及质谱鉴定；(6)结果利用ImageMaster5.0凝胶图像分析软件获得20个差异表达蛋白质点，再通过NCBInr的Blast的检索，确定了其中1-16、18-20号差异表达蛋白的信息见下表，2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物溶液为5-苯基-1-(对甲基苯基)-1H-1,2,3-三唑化合物的甲醇溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：何文英，吴禄勇，陈光英，冯华杰，刘荣强，段红叶，
申请(专利权)人：海南师范大学，
类型：发明
国别省市：海南,46