一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器的构建和应用制造技术

本发明专利技术公开一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器的构建和应用，包括如下步骤：将制好的氧化锌阵列置于提取的天然叶绿素溶液中浸泡，天然叶绿素与ZnO表面共价结合；加入甲胎蛋白抗体（Ab）并固定至电极表面，用牛血清蛋白（BSA）封闭；最后，引入不同浓度的甲胎蛋白，通过检测抗原抗体特异性反应引起的光电流信号变化，以实现测定甲胎蛋白的目的。本发明专利技术所得到的天然叶绿素敏化剂制备方法绿色环保，操作简便快捷，制备的天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器生物相容性好，成本低，节能环保。因此，在光电生物传感技术和生物医学领域具有较好的应用前景。

Construction and Application of a Photoelectrochemical Immunosensor Based on Natural Chlorophyll Sensitized Zinc Oxide

The invention discloses the construction and application of a natural chlorophyll-sensitized zinc oxide-based photoelectrochemical immunosensor, which comprises the following steps: immersing the prepared zinc oxide array in the extracted natural chlorophyll solution, covalently binding the natural chlorophyll to the surface of zinc oxide, adding alpha-fetoprotein antibody (Ab) and fixing it to the electrode surface, sealing it with bovine serum albumin (BSA); and finally, introducing. Different concentrations of alpha-fetoprotein were added to detect the changes of photocurrent signal caused by specific reaction of antigen and antibody in order to achieve the purpose of alpha-fetoprotein determination. The preparation method of the natural chlorophyll sensitizer obtained by the invention is green, environmental friendly, simple and quick to operate, and the prepared natural chlorophyll sensitized zinc oxide-based photoelectrochemical immunosensor has good biocompatibility, low cost, energy saving and environmental protection. Therefore, it has a good application prospect in the field of photoelectric biosensor technology and biomedicine.

【技术实现步骤摘要】
一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器的构建和应用
本专利技术涉及一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器，将含有甲胎蛋白抗原的样品固定至制备好的BSA/Ab/CHL-ZnO电极上，检测其光电流变化值，带入所得方程，从而达到检测甲胎蛋白浓度的目的，属于分析化学和纳米材料领域。
技术介绍
光电化学型免疫传感器是一种利用光生电流或光生电压相关的待测物质浓度变化进行分析的新技术。其中，氧化锌作为一种非常重要的无机功能材料，具有良好的光电性能，以及无毒、化学稳定、生物相容性好等优点，可以广泛应用于光电化学生物传感技术。纯的氧化锌由于本身禁带宽度大，只能吸收紫外光，而天然色素对可见光具有良好的吸收，且生物相容性好，容易提取。近年来，纳米材料在光电化学生物传感器领域的研究也越来越多。纳米材料具备优异的物理、化学、电催化等性能，基于纳米材料的光电化学生物传感器体现出体积更小、速度更快、检测灵敏度更高等优异性能。而氧化锌作为一个重要的半导体陶瓷材料，具有许多有用的特性，如压电性、光吸收和发射、高电压-电流的非线性、对气体和化学制剂敏感和良好的催化活性。纯的氧化锌只能吸收紫外线，对可见光不灵敏，需使用增敏剂增敏。目前主要采用无机物（如贵金属、量子点）和有机物（大环化合物）对ZnO表面进行修饰，增强对可见光的吸收。但存在成本高、工艺复杂、生物相容性差等缺点，特别是有机物的合成过程往往会造成环境污染。而天然色素来源丰富，生物相容性好，容易提取，绿色环保。利用天然色素敏化作用不但可使ZnO受可见光照射而产生光电流，而且可使半导体电极自身不受激发，因而可避免因腐蚀、溶解而引起的消耗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器，以及用于甲胎蛋白检测的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器的构建方法，包括如下步骤：1）对ITO玻璃进行清洗，然后采用旋涂法，将乙酸锌溶于乙醇形成溶液，将乙酸锌乙醇溶液平铺在干燥的ITO玻璃上，煅烧后在ITO表面形成种子层；2）配制由六水合硝酸锌，六次甲基四胺，聚乙烯亚胺组成的水溶液，然后加入氨水，并用纯净水制成ZnO纳米阵列结构生长液；3）将上述步骤1）制得的表面负载有ZnO种子层的ITO玻璃浸入到步骤2）制得的ZnO纳米阵列生长液中，在85℃下反应4h，并在450℃下煅烧后制得ZnO纳米材料，将ZnO纳米材料上的多余ZnO刮去后即得ZnO电极；4）采摘并清洗绿黄葛树叶，除去叶脉，风干，将其剪碎后加入二氧化硅研磨以防止叶绿素被破坏，加入乙醇浸泡，过滤即得叶绿素提取液，浓缩叶绿素获得叶绿素浓缩液，将步骤3）制备好的ZnO电极放入装有叶绿素浓缩液的烧杯中浸泡，浸泡后取出并用乙醇清洗以去除黏附物，干燥后得到天然叶绿素增敏ZnO纳米材料（CHL-ZnO），将天然叶绿素增敏ZnO纳米材料上的多余ZnO刮掉后，即得CHL-ZnO电极；5）将甲胎蛋白抗体（Ab）引入到步骤4）获得的CHL-ZnO电极上：取10µL100µg/mL甲胎蛋白抗体（Ab）滴加到CHL-ZnO电极上，并于37℃孵化，用纯净水漂洗数次后获得Ab/CHL-ZnO电极；6）取15µL1wt%牛血清蛋白（BSA）封闭液滴加至步骤5）制得的Ab/CHL-ZnO电极上，并于37℃孵化以封闭非特异性结合位点，纯净水漂洗后，得到的电极（BSA/Ab/CHL-ZnO）作为光电化学免疫传感器。本专利技术一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器的应用，包括如下步骤：1）将制好的氧化锌阵列置于提取的天然叶绿素溶液中浸泡，天然叶绿素与ZnO表面共价结合；2）加入甲胎蛋白抗体（Ab）并固定至电极表面，用牛血清蛋白（BSA）封闭；最后，引入不同浓度的甲胎蛋白，通过检测抗原抗体特异性反应引起的光电流信号变化，以实现测定甲胎蛋白的目的。本专利技术所述的天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器的检测甲胎蛋白抗原的方法，包括如下步骤：将0.005ng/mL~50ng/mL不同浓度的甲胎蛋白抗原（Ag）固定至BSA/Ab/CHL-ZnO电极上，检测其光电流变化值，随着甲胎蛋白抗原浓度增加，光电流信号越弱，在0.005ng/mL~50ng/mL浓度范围内，光电流信号与甲胎蛋白抗原（Ag）浓度对数呈线性关系。具体地说，本专利技术采用以下技术方案：所述的一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器，其特征是以天然叶绿素作为敏化剂，增强氧化锌在可见光照射下的光电流响应，以引入甲胎蛋白抗原抗体的天然叶绿素敏化氧化锌（CHL-ZnO）电极作为工作电极进行光电流检测。上述CHL-ZnO材料由以下方法制备获得：清洗导电玻璃（ITO）电极，并在导电面旋涂5mM乙酸锌生长溶液，300℃煅烧20min，置于含有15mM六亚甲基四胺、30mM六水合硝酸锌、10mM聚乙烯亚胺和0.5M氨水的水溶液85℃水浴4h，取出干燥后450℃煅烧30min，得到ZnO纳米材料；将氧化锌纳米材料上的ZnO刮去1*0.5cm，即得ZnO电极。用200mL乙醇浸泡绿黄葛树叶4h，得到天然色素提取液，过滤后浓缩4倍，并将干燥好的ZnO纳米材料置于提取液中浸泡16h，用乙醇洗去表面未附上的色素，取出干燥后得到天然叶绿素敏化ZnO纳米材料；将天然叶绿素增敏ZnO纳米材料上的ZnO刮去1*0.5cm，即得CHL-ZnO电极。一种基于天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器检测甲胎蛋白的方法，包括如下步骤：1）ITO电极放入清洁剂、去离子水、丙酮、乙醇等超声清洗后，将乙酸锌生长液平铺于ITO电极上，经过煅烧和水浴得到ZnO纳米材料；将ZnO纳米材料上的ZnO刮去1*0.5cm，即得ZnO电极。2）提取绿黄葛树叶的天然叶绿素（CHL），将ZnO纳米材料放入天然叶绿素溶液中浸泡，得到天然叶绿素敏化ZnO纳米材料（CHL-ZnO）；将天然叶绿素增敏ZnO纳米材料上的ZnO刮去1*0.5cm，即得CHL-ZnO电极。并在上面引入甲胎蛋白抗体，构建成氧化锌基光电化学生物传感器；3）采用三电极体系进行测试，以CHL-ZnO电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1M磷酸盐缓冲溶液中，以氙灯光源模拟可见光照射，检测光致电流信号；4）以光致电流信号对甲胎蛋白浓度作图得到标准曲线，光电流信号与甲胎蛋白抗原浓度对数在0.005ng/mL~50ng/mL范围内呈线性关系。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，在缓冲溶液所添加的电解质为NaCl，电解质浓度为0.1M。本专利技术采用的具体技术方案如下：（一）天然叶绿素敏化ZnO的制备依次采用清洁剂、去离子水、丙酮、乙醇等对ITO玻璃进行超声清洗，然后采用旋涂法，将5nM乙酸锌溶液平铺在干燥的ITO上，300℃煅烧20min，在ITO表面形成种子层。再配制含有30mMZn(NO3)2、15mM六亚甲基四胺、10mM聚乙烯亚胺以及0.5MNH3·H2O的ZnO生长液。将上述负载有ZnO种子层的ITO浸入到生长液中，在85℃下反应4h，并在450℃下煅烧30min，制得ZnO纳米材料；将ZnO纳米材料上的ZnO刮去1*0.5cm，即得ZnO电极。采摘并清洗绿黄葛树叶，除去叶脉，风干，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器的构建方法，包括如下步骤：1）对ITO玻璃进行清洗，然后采用旋涂法，将乙酸锌溶于乙醇形成溶液，将乙酸锌乙醇溶液平铺在干燥的ITO玻璃上，煅烧后在ITO表面形成种子层；2）配制由六水合硝酸锌，六次甲基四胺，聚乙烯亚胺组成的水溶液，然后加入氨水，并用纯净水制成ZnO纳米阵列结构生长液；3）将上述步骤1）制得的表面负载有ZnO种子层的ITO玻璃浸入到步骤2）制得的ZnO纳米阵列生长液中，在85 ℃下反应4 h，并在450 ℃下煅烧后制得ZnO纳米材料，将ZnO纳米材料上的多余ZnO刮去后即得ZnO电极；4）采摘并清洗绿黄葛树叶，除去叶脉，风干，将其剪碎后加入二氧化硅研磨以防止叶绿素被破坏，加入乙醇浸泡，过滤即得叶绿素提取液，浓缩叶绿素获得叶绿素浓缩液，将步骤3）制备好的ZnO电极放入装有叶绿素浓缩液的烧杯中浸泡，浸泡后取出并用乙醇清洗以去除黏附物，干燥后得到天然叶绿素增敏ZnO纳米材料（CHL‑ZnO），将天然叶绿素增敏ZnO纳米材料上的多余ZnO刮掉后，即得CHL‑ZnO电极；5）将甲胎蛋白抗体（Ab）引入到步骤4）获得的CHL‑ZnO电极上：取10 µL 100 µg/mL 甲胎蛋白抗体（Ab）滴加到CHL‑ZnO电极上，并于37 ℃ 孵化，用纯净水漂洗数次后获得Ab/CHL‑ZnO电极；6）取15 µL 1 wt % 牛血清蛋白（BSA）封闭液滴加至步骤5）制得的Ab/CHL‑ZnO电极上，并于37 ℃ 孵化以封闭非特异性结合位点，纯净水漂洗后，得到的电极（BSA/Ab/CHL‑ZnO）作为光电化学免疫传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种天然叶绿素敏化氧化锌基光电化学免疫传感器的构建方法，包括如下步骤：1）对ITO玻璃进行清洗，然后采用旋涂法，将乙酸锌溶于乙醇形成溶液，将乙酸锌乙醇溶液平铺在干燥的ITO玻璃上，煅烧后在ITO表面形成种子层；2）配制由六水合硝酸锌，六次甲基四胺，聚乙烯亚胺组成的水溶液，然后加入氨水，并用纯净水制成ZnO纳米阵列结构生长液；3）将上述步骤1）制得的表面负载有ZnO种子层的ITO玻璃浸入到步骤2）制得的ZnO纳米阵列生长液中，在85℃下反应4h，并在450℃下煅烧后制得ZnO纳米材料，将ZnO纳米材料上的多余ZnO刮去后即得ZnO电极；4）采摘并清洗绿黄葛树叶，除去叶脉，风干，将其剪碎后加入二氧化硅研磨以防止叶绿素被破坏，加入乙醇浸泡，过滤即得叶绿素提取液，浓缩叶绿素获得叶绿素浓缩液，将步骤3）制备好的ZnO电极放入装有叶绿素浓缩液的烧杯中浸泡，浸泡后取出并用乙醇清洗以去除黏附物，干燥后得到天然叶绿素增敏ZnO纳米材料（CHL-ZnO），将天然叶绿素增敏ZnO纳米材料上的多余ZnO刮掉后，即得CHL-ZnO电极；5）将甲胎蛋白抗体（Ab）引入到步骤4）获得的CHL-ZnO电极上：取10µL100µg/mL甲胎蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩志钟，翁清花，张思颖，朱莉莉，郑小娜，李小芬，黄起杰，刘鹏辉，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35