The invention discloses a method for rapid identification of strawberry chromosome ploidy: taking wild forest strawberry induced by mutagenesis as test material and diploid wild forest strawberry as control; using test material and control leaves, respectively, preparing cell nucleus suspension after dyeing and cell nucleus suspension after control dyeing; detecting the two suspensions on flow cytometry, the method is convenient. The ploidy of the samples was analyzed by histogram of relative DNA content, and the ploidy variant plants were screened out. The invention also provides a method for chromosome doubling of Strawberry by using the method of rapid identification of strawberry chromosome ploidy, which uses amsulfurin to double the chromosome of diploid wild forest strawberry. The method of the invention can effectively obtain doubled offspring of strawberry.
【技术实现步骤摘要】
草莓染色体加倍法及所用的倍性快速鉴定方法
本专利技术涉及利用氨磺乐灵进行二倍体野生草莓加倍并用细胞流式仪快速鉴定染色体倍性的方法。
技术介绍
草莓是多年生常绿草本植物,属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria),染色体基数为x=7,其染色体倍性有二倍体(2x)、四倍体(4x)、五倍体(5x)、六倍体(6x)、八倍体(8x)及少量的十倍体(10x)和十二倍体(12x)。目前世界各地商品化种植的草莓品种均属于八倍体(2n=8x=56)大果凤梨草莓(Fragaria×ananassaDuch.),全世界草莓属约有20个常见种,除大果栽培种凤梨草莓外,其余种均为野生状态。野生草莓具有许多优良性状,尤其在抗寒、抗病、固形物含量、芳香性、抗氧化物质含量高等方面更具独特之处,是改良现代栽培草莓的重要基因资源。我国自然分布有11个种,是世界上野生草莓种类最丰富的国家,而且很多是珍稀类型。比如野生的森林草莓(F.vescaL.)抗病性良好,与栽培草莓相比,几乎没有发生炭疽病。在草莓染色体加倍的研究中,有报道的均以秋水仙素作为加倍剂,但秋水仙素是一种剧毒物质,使用剂量过低无法获得加倍材料,剂量过高对处理材料具有毒副作用,同时对操作规程有严格要求,对人、畜及环境存在较大安全隐患。氨磺乐灵能与微管、微丝蛋白特异性结合,能阻止正在分裂的植物细胞内的纺锤丝的形成,在药效消失后细胞又能恢复常态,重新进行分裂并形成多倍,与秋水仙素相比用量少毒性低。BeatrizPintos(2006)等分别采用氨磺乐灵和秋水仙素处理欧洲栓皮栎(Corkoak)单倍体胚囊来获得二倍体植株,氨 ...
【技术保护点】
1.草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是:以野生森林草莓诱导获得的诱变后草莓作为试材,以二倍体的野生森林草莓为对照;将试材和对照分别进行以下操作:取叶片制备成草莓细胞核染色悬液;从而分别得试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液;将上述试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液在流式细胞仪上检测,利用DNA相对含量的直方图来进行试材的倍性分析,并从中筛选出倍性发生变异的单株。
【技术特征摘要】
1.草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是:以野生森林草莓诱导获得的诱变后草莓作为试材,以二倍体的野生森林草莓为对照;将试材和对照分别进行以下操作:取叶片制备成草莓细胞核染色悬液;从而分别得试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液;将上述试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液在流式细胞仪上检测,利用DNA相对含量的直方图来进行试材的倍性分析,并从中筛选出倍性发生变异的单株。2.根据权利要求1所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是:调整流式细胞仪的检测参数,使对照染色后细胞核悬液的DNA含量峰值出现在200处,获得对照检测直方图;保持流式细胞仪的检测参数不变,对试材染色后细胞核悬液进行检测,从而获得试材检测直方图;当试材检测直方图的DNA含量峰值出现在200处时,判定该试材所对应的诱变后单株为二倍体,当试材检测直方图的DNA含量峰值出现在400处时,判定该试材所对应的诱变后单株为四倍体。3.根据权利要求1或2所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是所述草莓细胞染色核悬液的制备方法为依次进行以下步骤:①、取50mg草莓叶片加入1mL预冷OTTOI缓冲液,将叶片粉碎均匀搅拌混合,70μm过滤器过滤后进行首次低温离心;②、在首次低温离心所得的沉淀中再加入1mL预冷OTTOI缓冲液均匀混合后进行二次低温离心;③、在二次低温离心所得的沉淀中加入混合液600μL、10μLRnase酶和50μLPI混匀后避光条件下于4±1℃放置15±2min从而实现染色,然后用40μm过滤器过滤,得草莓细胞核染色悬液;所述混合液由预冷的OTTOI缓冲液与OTTOⅡ缓冲液按照1:2的体积比混合而得。4.根据权利要求3所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是所述步骤①的首次低温离心和步骤②的二次低温离心均为:1000±200r·min-1、4±1℃离心5±1min。5.根据权利要求3所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是:OTTOⅠ缓冲液的制备方法为:称取1.9214g柠檬酸,加入去离子水溶解,加入500μL吐温20搅拌均匀,加入2~3g聚乙烯吡咯烷酮搅拌至溶解,然后用去离子水定容至100mL,0.2μm过滤灭菌;OTTOⅡ缓冲液的制备方法为:称取5.6784g磷酸氢二钠,加入去离子水溶解,然后用去离子水定容至100mL,0.2μm过滤灭菌。6.利用权利要求1~5任一所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法进行的草莓染色体加倍法,其特征是依次包括以下步骤:1)、取生...
【专利技术属性】
技术研发人员:王淑珍,余红,柴伟国,周历萍,来文国,童建新,
申请(专利权)人:杭州市农业科学研究院,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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