草莓染色体加倍法及所用的倍性快速鉴定方法技术

技术编号:20093247 阅读:25 留言:0更新日期:2019-01-15 12:38
本发明专利技术公开了一种草莓染色体倍性快速鉴定方法:以野生森林草莓诱导获得的诱变后草莓作为试材,以二倍体的野生森林草莓为对照;利用试材和对照的叶片,分别制备获得试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液;将上述两种悬液在流式细胞仪上检测,利用DNA相对含量的直方图来进行试材的倍性分析,并从中筛选出倍性发生变异的单株。本发明专利技术还同时提供了利用上述草莓染色体倍性快速鉴定方法进行的草莓染色体加倍法,该方法利用氨磺乐灵对二倍体野生森林草莓进行染色体加倍。采用本发明专利技术的方法能有效地获得草莓加倍后代。

Strawberry Chromosome Doubling Method and Rapid Ploidy Identification Method

The invention discloses a method for rapid identification of strawberry chromosome ploidy: taking wild forest strawberry induced by mutagenesis as test material and diploid wild forest strawberry as control; using test material and control leaves, respectively, preparing cell nucleus suspension after dyeing and cell nucleus suspension after control dyeing; detecting the two suspensions on flow cytometry, the method is convenient. The ploidy of the samples was analyzed by histogram of relative DNA content, and the ploidy variant plants were screened out. The invention also provides a method for chromosome doubling of Strawberry by using the method of rapid identification of strawberry chromosome ploidy, which uses amsulfurin to double the chromosome of diploid wild forest strawberry. The method of the invention can effectively obtain doubled offspring of strawberry.

【技术实现步骤摘要】
草莓染色体加倍法及所用的倍性快速鉴定方法
本专利技术涉及利用氨磺乐灵进行二倍体野生草莓加倍并用细胞流式仪快速鉴定染色体倍性的方法。
技术介绍
草莓是多年生常绿草本植物,属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria),染色体基数为x=7,其染色体倍性有二倍体(2x)、四倍体(4x)、五倍体(5x)、六倍体(6x)、八倍体(8x)及少量的十倍体(10x)和十二倍体(12x)。目前世界各地商品化种植的草莓品种均属于八倍体(2n=8x=56)大果凤梨草莓(Fragaria×ananassaDuch.),全世界草莓属约有20个常见种,除大果栽培种凤梨草莓外,其余种均为野生状态。野生草莓具有许多优良性状,尤其在抗寒、抗病、固形物含量、芳香性、抗氧化物质含量高等方面更具独特之处,是改良现代栽培草莓的重要基因资源。我国自然分布有11个种,是世界上野生草莓种类最丰富的国家,而且很多是珍稀类型。比如野生的森林草莓(F.vescaL.)抗病性良好,与栽培草莓相比,几乎没有发生炭疽病。在草莓染色体加倍的研究中,有报道的均以秋水仙素作为加倍剂,但秋水仙素是一种剧毒物质,使用剂量过低无法获得加倍材料,剂量过高对处理材料具有毒副作用,同时对操作规程有严格要求,对人、畜及环境存在较大安全隐患。氨磺乐灵能与微管、微丝蛋白特异性结合,能阻止正在分裂的植物细胞内的纺锤丝的形成,在药效消失后细胞又能恢复常态,重新进行分裂并形成多倍,与秋水仙素相比用量少毒性低。BeatrizPintos(2006)等分别采用氨磺乐灵和秋水仙素处理欧洲栓皮栎(Corkoak)单倍体胚囊来获得二倍体植株,氨磺乐灵浓度为0.01mmol﹒L-1,浸泡48h加倍效果最佳,约50%的单倍体胚囊被加倍,且对胚后期生长毒性最小;秋水仙素8.8mmol﹒L-1,处理72h加倍效果仅为22%,且对胚后期生长抵制最强。储丽红等(2014)用氨磺乐灵、秋水仙素对‘Dakota’安组花组培苗进行浸泡处理,15mg﹒L-1氨磺乐灵处理7d,死亡率14.58%,诱导率48.72%;0.5%秋水仙素处理5d,死亡率为31.11%,诱导率达62.96。目前国内尚未有氨磺乐灵在草莓上应用的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种草莓染色体加倍及所采用的倍性快速鉴定方法,本专利技术利用氨磺乐灵对二倍体野生森林草莓进行染色体加倍,并快速检测染色体倍性的方法,采用该方法能有效地获得加倍后代。为了解决上述技术问题,本专利技术提供一种草莓染色体倍性快速鉴定方法:以野生森林草莓诱导获得的诱变后草莓作为试材,以野生森林草莓(二倍体)为对照;将试材和对照分别进行以下操作:取叶片制备成草莓细胞核染色悬液;从而分别得试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液;将上述试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液在流式细胞仪上检测,利用DNA相对含量的直方图来进行试材的倍性分析,并从中筛选出倍性发生变异的单株(从而筛选出新种质材料)。作为本专利技术的草莓染色体倍性快速鉴定方法的改进:调整流式细胞仪的检测参数,使对照染色后细胞核悬液的DNA含量峰值出现在200处,获得对照检测直方图(即,直方图横坐标为200,出现DNA含量峰值);保持流式细胞仪的检测参数不变,对试材染色后细胞核悬液进行检测,从而获得试材检测直方图;当试材检测直方图的DNA含量峰值出现在200处时,判定该试材所对应的诱变后单株为二倍体,当试材检测直方图的DNA含量峰值出现在400处时,判定该试材所对应的诱变后单株为四倍体。备注说明:可选用美国贝克曼公司型号为Quanta.SC的流式细胞仪。DNA荧光染料可定量结合在DNA双链的碳架结构上,细胞内DNA分子数目越多,DNA分子链越长,荧光染料嵌入碳架结构中的量就越多,经激光照射,这些DNA猝发荧光的强度也就越强。由于DNA含量与荧光信号强度成正比关系,细胞发出的荧光信号强度可代表所测细胞内的DNA含量,而细胞内DNA含量与倍性相互关系,因而可用于植物倍性鉴定。作为本专利技术的草莓染色体倍性快速鉴定方法的进一步改进,所述草莓细胞染色核悬液的制备方法为依次进行以下步骤:①、取50mg草莓叶片加入1mL预冷(4±1℃)OTTOI缓冲液,将叶片粉碎均匀搅拌混合,70μm过滤器过滤(可过滤至1.5mL离心管)后进行首次低温离心(弃上清液);②、在首次低温离心所得的沉淀中再加入1mL预冷(4±1℃)OTTOI缓冲液均匀混合后进行二次低温离心(弃上清液);③、在二次低温离心所得的沉淀中加入混合液600μL、10μLRnase酶(浓度为10mg﹒mL-1)和50μLPI(BDPharmingenTM,PI/RNaseStainingBuffer)混匀后避光条件下于4±1℃放置15±2min从而实现染色,然后用40μm过滤器过滤,得草莓细胞核染色悬液(用于上机检测);所述混合液由预冷(4±1℃)的OTTOI缓冲液与OTTOⅡ缓冲液按照1:2的体积比混合而得。作为本专利技术的草莓染色体倍性快速鉴定方法的进一步改进:所述步骤①的首次低温离心和步骤②的二次低温离心均为:1000±200r·min-1、4±1℃离心5±1min。作为本专利技术的草莓染色体倍性快速鉴定方法的进一步改进:OTTOⅠ缓冲液的制备方法为:称取1.9214g柠檬酸,加入去离子水溶解,加入500μL吐温20搅拌均匀,加入2~3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)搅拌至溶解,然后用去离子水定容至100mL,0.2μm过滤灭菌;注:该OTTOⅠ缓冲液pH2~3,需4℃冷藏;OTTOⅡ缓冲液的制备方法为:称取5.6784g磷酸氢二钠,加入去离子水溶解,然后用去离子水定容至100mL,0.2μm过滤灭菌;注:该OTTOⅡ缓冲液的pH8~9,常温保存。本专利技术还同时提供了利用上述草莓染色体倍性快速鉴定方法进行的草莓染色体加倍法,依次包括以下步骤:1)、取生长健壮且无病虫害的野生森林草莓(二倍体)的匍匐茎,取茎尖处1~2cm的长度作为茎尖段,流水冲洗(放入纱袋中用自来水冲洗);2)、将上述流水冲洗后的茎尖段经消毒(常规消毒)后,割取3.0~5.0毫米作为茎尖小段,接种到诱导无菌苗培养基上进行培养;培养条件为:16小时光照,光照强度30~40μmolm-2·s-1,温度为25±1℃;8小时暗培养,温度为21±1℃;上述光照和暗培养交替进行;直至获得1.0~2.0cm高的无菌苗;3)、将步骤2)所得的无菌苗接种到增殖培养基上进行培养;培养条件为:16小时光照,光照强度30~40μmolm-2·s-1,温度为25±1℃;8小时暗培养,温度为21±1℃;上述光照和暗培养交替进行;每30~35d继代一次;此时,每个无菌苗上长出侧枝小苗(一般,每个无菌苗上能长出3~5个长度约为0.8~1.5cm的侧枝小苗);4)、以步骤2)所得的长至1.0~2.0cm的无菌苗或者步骤3)继代所得的侧枝小苗为试材,先将试材接种至诱变加倍培养基中培养处理14±1天,得诱变后单株;每个诱变后单株转接入增殖培养基中进行继代培养,每30~35d继代一次,从而获得侧枝单株(即,此时,每个单株上能长出3~5个侧枝单株);上述在诱变加倍培养基中的培养处理、以及在增殖培养基中的继代培养,均满足以下培养条件:16小时光照,光照本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是:以野生森林草莓诱导获得的诱变后草莓作为试材,以二倍体的野生森林草莓为对照;将试材和对照分别进行以下操作:取叶片制备成草莓细胞核染色悬液;从而分别得试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液;将上述试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液在流式细胞仪上检测,利用DNA相对含量的直方图来进行试材的倍性分析,并从中筛选出倍性发生变异的单株。

【技术特征摘要】
1.草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是:以野生森林草莓诱导获得的诱变后草莓作为试材,以二倍体的野生森林草莓为对照;将试材和对照分别进行以下操作:取叶片制备成草莓细胞核染色悬液;从而分别得试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液;将上述试材染色后细胞核悬液和对照染色后细胞核悬液在流式细胞仪上检测,利用DNA相对含量的直方图来进行试材的倍性分析,并从中筛选出倍性发生变异的单株。2.根据权利要求1所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是:调整流式细胞仪的检测参数,使对照染色后细胞核悬液的DNA含量峰值出现在200处,获得对照检测直方图;保持流式细胞仪的检测参数不变,对试材染色后细胞核悬液进行检测,从而获得试材检测直方图;当试材检测直方图的DNA含量峰值出现在200处时,判定该试材所对应的诱变后单株为二倍体,当试材检测直方图的DNA含量峰值出现在400处时,判定该试材所对应的诱变后单株为四倍体。3.根据权利要求1或2所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是所述草莓细胞染色核悬液的制备方法为依次进行以下步骤:①、取50mg草莓叶片加入1mL预冷OTTOI缓冲液,将叶片粉碎均匀搅拌混合,70μm过滤器过滤后进行首次低温离心;②、在首次低温离心所得的沉淀中再加入1mL预冷OTTOI缓冲液均匀混合后进行二次低温离心;③、在二次低温离心所得的沉淀中加入混合液600μL、10μLRnase酶和50μLPI混匀后避光条件下于4±1℃放置15±2min从而实现染色,然后用40μm过滤器过滤,得草莓细胞核染色悬液;所述混合液由预冷的OTTOI缓冲液与OTTOⅡ缓冲液按照1:2的体积比混合而得。4.根据权利要求3所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是所述步骤①的首次低温离心和步骤②的二次低温离心均为:1000±200r·min-1、4±1℃离心5±1min。5.根据权利要求3所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法,其特征是:OTTOⅠ缓冲液的制备方法为:称取1.9214g柠檬酸,加入去离子水溶解,加入500μL吐温20搅拌均匀,加入2~3g聚乙烯吡咯烷酮搅拌至溶解,然后用去离子水定容至100mL,0.2μm过滤灭菌;OTTOⅡ缓冲液的制备方法为:称取5.6784g磷酸氢二钠,加入去离子水溶解,然后用去离子水定容至100mL,0.2μm过滤灭菌。6.利用权利要求1~5任一所述的草莓染色体倍性快速鉴定方法进行的草莓染色体加倍法,其特征是依次包括以下步骤:1)、取生...

【专利技术属性】
技术研发人员:王淑珍余红柴伟国周历萍来文国童建新
申请(专利权)人:杭州市农业科学研究院
类型:发明
国别省市:浙江,33

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