本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种番茄晚疫病抗病基因Ph‑3的四重SNP分子标记物及开发方法，番茄晚疫病抗病基因Ph‑3的四重SNP分子标记物为两对引物，其中一对引物的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2；另一对引物的序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。本发明专利技术的标记是根据Ph‑3基因序列开发的基因标记，特异性高，减少假阳性的存在；本发明专利技术标记在使用过程中选择精确度高，操作简单，无需酶切，只需一次PCR反应和一次凝胶电泳就可以区分抗病、感病、杂抗三种基因型等优点；在分子标记辅助育种过程中节省了时间，节约了耗材，从而提高了育种效率。
【技术实现步骤摘要】
番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物及开发方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物及开发方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，已经发展成为全球产量最高的30中农作物之一，在我国南北各地广泛种植。番茄晚疫病在中国南北各地均有发生，尤其在潮湿多雨的南方地区和保护地番茄上发生严重。番茄晚疫病的爆发与流行已严重威胁到中国番茄生产，通常年份减产10％-30％，病害流行时可以达到80％，甚至绝产。番茄晚疫病是由致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)引起的一种真菌性病害，可侵染番茄的果实、茎、叶而引起严重的危害。目前在野生番茄中发现了多个抗晚疫病基因，包括Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4、Ph-5-1和Ph-5-2。到目前为止，被克隆的抗病基因仅Ph-3，针对此抗病基因也开发了一些标记，如TG328，TG591，SCU602F3R3，SCAR‐Ph3‐1，SCAR‐Ph3‐2，SCAR‐Ph3‐3，NC-LB-9-6676，NC-LB-9-6677，NC-LB-9-6678，NC-LB-9-6679，CCPB272-03740和Ph3.gsm/HincII，其中TG328是使用最为广泛，Ph3.gsm/HincII为最近开发的标记，特异性与其他标记相比较强(Wangetal.2016)。我们在使用基因型丰富的一组栽培种验证TG328与Ph3.gsm/HincII时，发现它们存在带型不稳定，特异性不强等问题，且这两个标记在使用过程中需要酶切，耗时较长，因此目前急需要一种带型稳定且特异性强的标记。单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指群体基因组DNA序列中单个碱基的变化，包括单个碱基的插入、缺失和替换。根据已知基因序列，利用SNP位点可以开发出有效的基因标记，与其他分子标记相比，SNP基因标记具有以下优点：数量多，分布广；富有代表性；遗传稳定性高；便于检测。目前，开发SNP基因标记过程中应用最广泛的是CAPS技术和等位基因特异PCR技术。CAPS的基本原理是利用在限制性内切酶的酶切位点上突变的SNP开发标记。在SNP上下游设计一对引物，进行PCR，然后使用对应的限制性内切酶对PCR产物进行酶切。在酶切位点发生突变的SNP可导致限制性内切酶无法识别酶切位点，因此可根据PCR产物酶切后的带型判断基因型。等位基因特异PCR技术(AS-PCR)的基本原理是根据一个SNP位点设计特异引物，其中一条引物链的3'末端与SNP位点一种碱基类型相同或互补，另一条引物链按照正常引物设计的方法即可。特异引物只在一种基因型中有扩增的产物，在另一种基因型中没有。因此用凝胶电泳显示扩增产物的有无，从而确定SNP基因型。另外，为了提高引物的特异性，很多研究者提出在3’端的第二或第三位引入错配碱基，该错配碱基与3’末端的错配碱基共同作用，大大降低了引物与其3’末端不互补模板之间的错误延伸，从而提高了AS-PCR的准确性。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术开发的Ph3.gsm/HincII标记部分杂抗带型和纯抗带型一致，且带型不稳定。不具有带型稳定且特异性强的共显性特征。(2)现有的标记在验证特异性时，使用的材料类型不丰富，多为基因型单一的双亲材料。(3)现有的标记中相对较好的TG328和Ph3.gsm/HincII在使用过程中都需要酶切处理，耗时较长。解决上述技术问题的意义：通过搜集基因型丰富的材料进行检验，并做接病实验进行验证，确保标记的普适性。用来源于两种不同种的番茄(野生型和栽培型)同源基因序列与Ph-3序列进行多重比对，筛出特异位点设计标记，保证了标记的特异性。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物及开发方法。本专利技术针对四重SNP做了进一步改进，设计引物时遵循AS-PCR错配碱基引入的设计方法，使得引物的特异性更高。本专利技术是这样实现的，一种番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物，所述番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物为两对引物，其中一对引物的DNA序列为SEQIDNO：1、SEQIDNO：2；另一对引物的DNA序列为SEQIDNO：3、SEQIDNO：4。本专利技术的另一目的在于提供一种开发方法包括：搜集不同基因型相关核苷酸序列信息,从数据库中找到LA1589和Heinz1706的Ph-3感病序列；将Ph-3抗病序列和LA1589和heinz1706进行多重比对；找到4个核苷酸多态性在LA1589、Heinz1706和Ph-3以及它的同源序列中具有高度可辨性的位点。进一步，找到的4个碱基突变位点设计引物后，需进行：根据找到的4个碱基突变位点设计引物，引物的设计遵循AS-PCR错配碱基引入的设计方法；在正向引物3’末端前一个碱基引入错配，将T换成C；其中一对引物的正反向引物的3’末端均与感病SNP位点匹配，得到感病引物Ph-3-GL-S；另一对引物的正反向引物的3’末端均与抗病SNP位点匹配，得到抗病引物Ph-3-GL-R；将设计好的感病引物Ph-3-GL-S、抗病引物Ph-3-GL-R进行合成，得到：正向引物Ph-3-GL-R-F:GCTACCTTAATTATTTACAATTTTCCT；反向引物Ph-3-GL-R-R:TTGTGAAACAGAAAAGGTAAATATCA；正向引物Ph-3-GL-S-F:CGAAATAATGATGTAGGCAGATACACA；反向引物Ph-3-GL-S-R:GTTGAGAAAATAGGCAAGTATCATC。感病引物Ph-3-GL-S扩增出设计长度条带或非设计条带；对扩增出来的非设计条带进行测序；扩增出的非设计条带中Ph-3基因能代表易感等位基因；抗病引物Ph-3-GL-R在抗病材料中扩增出特异性条带。进一步，得到四个引物序列后，需进行：PCR扩增与电泳检测：PCR反应体系：总体积20μL；10XEasyTaqbuffer2.0μL，浓度10mMdNTP0.4μL，浓度100μMPh-3-GL-S正反引物各0.09μL，浓度100μMPh-3-GL-R正反引物100μM各0.04μL，DNA模板2μL(100-200ng/μL)，EasyTaq酶0.2μL，ddH2O15.1μL；PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min；凝胶电泳检测：PCR产物用1.5％琼脂糖在120-130V电压条件下电泳15-20min，结果在凝胶成像系统上显示。本专利技术的另一目的在于提供一种四重SNP分子标记物在检测番茄晚疫病抗病基因Ph-3中的应用。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术的优点有，不同标记材料验证结果如下表：标记名称总材料数假阳性条带模糊无法区分条带Ph3.gsm/HmcII48012TG32848700Ph-3-GL-R/S48000。本专利技术的标记是根据Ph-3基因序列开发的基因标记，特异性高，减少假阳性的存在。本专利技术标记本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种番茄晚疫病抗病基因Ph‑3的四重SNP分子标记物，其特征在于，所述番茄晚疫病抗病基因Ph‑3的四重SNP分子标记物为两对引物，其中一对引物的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2；另一对引物的序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
【技术特征摘要】
1.一种番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物，其特征在于，所述番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物为两对引物，其中一对引物的序列为SEQIDNO：1、SEQIDNO：2；另一对引物的序列为SEQIDNO：3、SEQIDNO：4。2.一种如权利要求1所述番茄晚疫病抗病基因Ph-3的四重SNP分子标记物的开发方法，其特征在于，所述开发方法包括：根据找到的4个多碱基突变位点设计引物，引物的设计遵循AS-PCR错配碱基引入的设计方法；在正向引物3’末端前一个碱基引入错配，将T换成C；其中一对引物的正反向引物的3’末端均与感病SNP位点匹配，得到感病引物Ph-3-GL-S；另一对引物的正反向引物的3’末端均与抗病SNP位点匹配，得到抗病引物Ph-3-GL-R；将设计好的感病引物Ph-3-GL-S、抗病引物Ph-3-GL-R进行合成，得到：正向引物Ph-3-GL-R-F:GCTACCTTAATTATTTACAATTTTCCT；反向引物Ph-3-GL-R-R:TTGTGAAACAGAAAAGGTAAATATCA；正向引物Ph-3-GL-S-F:CGAAATAATGATGTAGGCAGATACACA；反向引物Ph-3-GL-S-R:GTTGAGAAAATAGGCAAGTATCATC。3.如权利要求2所述的开发方法，其特征在于，选取的两对引物之间在全基因组上有一定的物理距离；感病引物Ph-3-GL-S扩增出设计长度条带...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶志彪，任志勇，游泽爽，张俊红，张余洋，欧阳波，王涛涛，李汉霞，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。