肝细胞癌RNA生物标志物制造技术

本发明专利技术提供肝细胞癌生物标志物，所述肝细胞癌生物标志物选自mRNA标志物：ZIC5，C12orf75，C1QL1，TMEM74，GNAZ，FAM65C和PZP；lncRNA标志物：LNC‑TOB2P1，LOC100499489，LNC‑NMRAL2p，LNC‑NBPF22P，LINC01093，LOC100130899，LOC200772和LNC‑FENDRR；microRNA标志物：miR‑200a‑3p，miR‑200b‑3p，miR‑139‑5p和miR‑10‑3p，以及circRNA标志物：circAKR1B10，circAKR1C3，circHMGCS1和circC3P1。

【技术实现步骤摘要】
肝细胞癌RNA生物标志物
本专利技术涉及生物学和医学领域，通过高通量测序筛选在肝细胞癌中验证了一系列不同类型的RNA生物标志物。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，亚洲和非洲是世界上发病率最高的国家，仅我国就占亚洲和非洲病例的一半。由于缺乏及早发现和及时治疗，5年生存率低于20％(McGlynnKA，etal.2011；LeeSS,etal.2012)。癌症生物标志物的发现为癌症的早期诊断和治疗提供了可能的解决方法(ChoWCS.2014)。大多数癌症病人被检测出时多是处于癌症晚期阶段，这主要是由于临床诊断缺少敏感的和特异的生物标志物。因此，早期诊断和疾病的准确分类是癌症治疗项目的关键因素。而这需要要有更有效的生物标志物的应用。数十年来，各种类型的生物标记的发现和应用，为许多种疾病临床治疗和诊断做出了很大贡献，相比其他类型的生物标记物，RNA生物标记作为一种新兴的生物标记物，具有许多优势，例如具有高灵敏性和特异性，相对于常见的蛋白标记物，RNA生物标记成本更低，相较于DNA生物标记，可以动态的观察到RNA进入细胞的状态和调节过程(XiX,etal.2017)。此外，一些新型的RNA，例如环形RNA标记物具有在血浆或血清中稳定性高，不易被降解等特点。本专利技术通过高通量测序对肝细胞癌中多种类型的RNA转录本进行筛选并在HCC临床样本中得以验证，共验证了23种RNA生物标志物。很多都是第一次在HCC中筛选到或是被验证的。这些生物标志物可以作为肝细胞癌的临床诊断和治疗药物的研发靶点。对HCC的未来治疗具有较强的参考和应用价值。专利技术内容本专利技术提供了肝细胞癌中特异有效的RNA生物标记物。专利技术人筛选出的多种RNA生物标志物对于肝细胞癌病人的临床诊断和治疗以及药物研发具有重要的应用价值和意义。具体地，本专利技术提供以下各项：1.肝细胞癌生物标志物，其为选自由以下各项组成的组的mRNA：ZIC5，C12orf75，C1QL1，TMEM74，GNAZ，FAM65C和PZP，其序列分别如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，和SEQIDNO.7所示。2.肝细胞癌生物标志物，其为选自由以下各项组成的组的lncRNA：LNC-TOB2P1，LOC100499489，LNC-NMRAL2p，LNC-NBPF22P，LINC01093，LOC100130899，LOC200772和LNC-FENDRR，其序列分别如SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11，SEQIDNO.12，SEQIDNO.13，SEQIDNO.14，和SEQIDNO.15所示。3.肝细胞癌生物标志物，其为选自由以下各项组成的组的microRNA：miR-200a-3p，miR-200b-3p，miR-139-5p和miR-10-3p，其序列分别如SEQIDNO.16，SEQIDNO.17，SEQIDNO.18，和SEQIDNO.19所示。4.肝细胞癌生物标志物，其为选自由以下各项组成的组的circRNA：circAKR1B10，circAKR1C3，circHMGCS1和circC3P1，其序列分别如SEQIDNO.20，SEQIDNO.21，SEQIDNO.22，和SEQIDNO.23所示。5.用于检测根据1-4中任一项所述的肝细胞癌生物标志物的试剂在制备用于诊断肝细胞癌的诊断剂中的用途。6.根据5所述的用途，其中所述用于检测根据1-4中任一项所述的肝细胞癌生物标志物的试剂是用于检测所述肝细胞癌生物标志物的引物。附图说明图1.本专利技术筛选出的7种mRNA生物标志物，其中N：癌旁正常肝组织，T：肝癌组织。图2.本专利技术筛选出的8种lncRNA生物标志物，其中N：癌旁正常肝组织，T：肝癌组织。图3.本专利技术筛选出的4种microRNA生物标志物，其中N：癌旁正常肝组织，T：肝癌组织。图4.本专利技术筛选出的4种circRNA生物标志物，其中N：癌旁正常肝组织，T：肝癌组织。具体实施方式提供以下实施例以便更好地理解本专利技术，而非限制本专利技术。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。组织样品来源：实施例中所用所有肝癌病人的癌组织及癌旁组织均来自中国科学技术大学第一附属医院。通过分别抽提肝癌组织及癌旁组织的总RNA，进行高通量测序筛选并在21例HCC病人的临床样本中进行验证。实施例实施例1.肝癌病人组织的收集：所有新鲜的肝癌病人的癌组织和癌旁组织都来自于中国科学技术大学第一附属医院。所有操作均通过中国科学技术大学伦理委员会的审核，以及病人及家属都签了知情同意书。伦理审批号为：USTCEC201700007。具体操作如下：病人癌组织和癌旁组织在手术切除离体后的半个小时候之内，分别从这些组织上取下黄豆大小的组织，用DEPC水浸泡过的手术镊子轻轻的夹取放进DEPC水中冲洗除去多余的残留血液。然后放进RNAhold缓冲液(TransGen)中暂时保存。实施例2.RNA抽提1)将组织用电动匀浆器充分研磨，一开始在无RNA酶的1.5mLEP管里加入约200ul的trizol试剂，待研磨充分后再加入800ultrizol。然后轻微震荡混匀。操作均在冰上进行。2)加入200μl三氯甲烷，轻轻震荡，室温静置5-10分钟。3)在4℃离心机中，12000g离心15min，使溶液分层。4)离心结束后，可见溶液分为三层，上层为澄清水相，中层和下层为有机相。其中RNA分布于上层水相中。有机相中为蛋白和DNA。5)小心吸出上层水相至新的无RNA酶的1.5mlEP管中，注意不要触碰到中间层以免导致DNA污染，加入等体积的异丙醇，混匀，放置在-80℃冰箱中静置20分钟。该步骤可以帮助RNA沉淀，并保持RNA的完整性。6)在4℃离心机中12000g离心15分钟，使RNA沉淀出来。7)加入1ml75％-80％冰乙醇，在4℃离心机中7500g离心5分钟清洗一遍。8)倒掉乙醇，晾干10分钟，加适量DEPC水溶解RNA。实施例3.RNA纯化(DNaseI消化)取39.5μlDEPC水溶解的RNA，加入5μl10XReactionBuffer，5μlRQ1RNase-FreeDNaseI，0.5μlRNaseInhibitor，在37度水浴锅中消化30分钟。加入5μlStopSolution，在72度水浴锅水浴5分钟，使DNaseI失活。加入3M醋酸钠(PH5.2)(50:1)和300μl无水乙醇，放入-80℃冰箱中沉淀120分钟以上。在4℃离心机里12000g离心15分钟，弃上清。加入1ml75％-80％冰乙醇，在4℃离心机中7500g离心5分钟清洗一遍。倒掉乙醇，室温晾干10分钟，加适量DEPC水溶解RNA实施例4.反转录(Promega反转录体系)1)测量RNA浓度，取300ng-500ngRNA进行反转。加入1μlrandomprimer/OligodT/genespecificprimer，用DEPC水补齐至10μl。2)放入72度金属浴上变性5分钟，然后放置在冰上2分钟在上述10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肝细胞癌生物标志物，其为选自由以下各项组成的组的mRNA：ZIC5，C12orf75，C1QL1，TMEM74，GNAZ，FAM65C和PZP，其序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，和SEQ ID NO.7所示。

【技术特征摘要】
1.肝细胞癌生物标志物，其为选自由以下各项组成的组的mRNA：ZIC5，C12orf75，C1QL1，TMEM74，GNAZ，FAM65C和PZP，其序列分别如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，和SEQIDNO.7所示。2.肝细胞癌生物标志物，其为选自由以下各项组成的组的lncRNA：LNC-TOB2P1，LOC100499489，LNC-NMRAL2p，LNC-NBPF22P，LINC01093，LOC100130899，LOC200772和LNC-FENDRR，其序列分别如SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11，SEQIDNO.12，SEQIDNO.13，SEQIDNO.14，和SEQIDNO.15所示。3.肝细胞癌生...

【专利技术属性】
技术研发人员：单革，盛治勇，王小林，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34