一种蛋白质核酸适配体的筛选方法技术

本发明专利技术是一种蛋白质核酸适配体的筛选方法。该方法将蛋白质包埋在聚苯乙烯96孔板或其它吸附蛋白质的器皿的表面；加入胰蛋白酶或蛋白酶消化降解蛋白质，使蛋白质与寡核苷酸结合复合物脱离容器表面，通过加热灭活蛋白酶并释放ssDNA；与蛋白特异性接合的ssDNA被富集，筛选得到亲和力高的适配体。本发明专利技术筛选方法无需对筛选文库和PCR引物进行修饰，在节约成本的同时不会对靶标结构有任何改变，从而增加了筛选出的适配体的特异性；它可以使与蛋白特异性接合的ssDNA被富集，提高了筛选效率，筛选得到的适配体的亲和力高。用于以蛋白质为靶标的核酸适配体筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质核酸适配体的筛选方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种核酸适配体筛选方法，适用于以蛋白质为靶标的核酸适配体的筛选。
技术介绍
核酸适配体是一类能够形成特定三维结构的官能化寡核苷酸序列，其可高亲和力和高特异性的与蛋白质、肽、毒素、金属离子和细胞等结合。核酸适配体被称为“化学抗体”，相对于传统抗体，其分子量小、特异性强、稳定性高等特点使其成为极具潜力的配体。尤其对于难以制备抗体的蛋白质，适配体的筛选使这些蛋白高灵敏度检测成为可能。核酸适配体在生物传感器、生物药物和分子识别探针等许多领域的研究中亦具有广泛的应用。目前多种以蛋白质为靶标的适配体及其筛选技术已见报道。但这些方法都需要将适配体筛选库进行化学修饰，如结合链霉亲和素标记的磁珠或琼脂糖微球体，化学修饰可能会改变靶蛋白的固有结构，使得筛选得到的适配体富集效率低，得到的适配体的亲和力和特异性降低。因此，探索一种不用改变靶标结构，获得高亲和力适配体的筛选方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、低成本的高富集率的蛋白质核酸适配体的筛选方法。该方法筛选得到的核酸适配体与其靶标蛋白能够高特异性和高亲和力结合，具有分子量小、稳定性高、可体外修饰、可化学合成、无免疫源性等优势。本专利技术的目的是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种蛋白质核酸适配体的筛选方法，其特点是：将蛋白质包埋在聚苯乙烯96孔板或其它吸附蛋白质的器皿的表面；加入胰蛋白酶或蛋白酶消化降解蛋白质，使蛋白质与寡核苷酸结合复合物脱离容器表面，通过加热灭活蛋白酶并释放ssDNA；与蛋白特异性接合的ssDNA被富集，筛选得到亲和力高的适配体。本专利技术所述的核酸适配体筛选方法，其进一步优选的技术方案是，其具体步骤如下：将蛋白分子包被在96孔聚苯乙烯板中，采用BSA或FBS封闭，再将寡核苷酸序列ssDNA加到包被蛋白的板孔中孵育一定时间，用缓冲液将未结合的寡核苷酸序列去除后，用胰蛋白酶稀释液消化96孔聚苯乙烯板中的蛋白-寡核苷酸复合物，再将全部溶液体系在沸水中煮沸至使蛋白变性；通过12000g离心20min除去沉淀来去除蛋白残留；采用PCR富集次级文库，利用不对称PCR及变性聚丙烯酰胺凝胶切胶来制备和纯化寡核苷酸单链；循环以上步骤7-10次后可得到富集的核酸适配体。本专利技术所述的核酸适配体筛选方法，其进一步优选的技术方案是，该筛选方法包括以下步骤：（1）合成碱基长度在60-120nt的随机ssDNA文库和20nt的两条引物；随机文库：5’-AACTACGCTCAGACAGACAC-（20-80）N-CTGTGATGCGACTATCTGAG-3’；5’引物：5’-AACTACGCTCAGACAGACAC-3’3’引物：5’-CTCAGATAGTCGCATCACAG-3’（2）筛选：将蛋白用蛋白质包被液稀释并包被在96孔聚苯乙烯板中，37℃缓慢振荡2h，移出溶液并PBS洗涤3次，加入等体积的牛血清白蛋白封闭，37℃缓慢振荡1h，用PBS-T即含有0.05％（v/v）Tween-20的PBS洗涤96孔聚苯乙烯板；将初始文库12000g离心5min后用结合pH7.6缓冲液稀释至50nM，95℃变性5min，冰上快速冷却15min；将上述处理的文库加入包被蛋白的96孔聚苯乙烯板中，37℃缓慢震荡孵育1h，用缓冲液清洗以去除未结合的寡核苷酸，再用胰蛋白酶稀释液将蛋白消化，胰蛋白酶：PBS=7:4（v/v），煮沸灭活胰蛋白酶，12000g离心20min去掉残留蛋白，通过醋酸钠与乙醇对得到的溶液去盐，得到能够与蛋白特异性结合的寡核苷酸；（3）常规PCR扩增：将步骤（2）中得到的寡核苷酸作为模板进行常规PCR扩增，得到扩增产物；（4）制备单链DNA文库：将步骤（3）中得到的PCR产物作为模板进行不对称PCR扩增，将扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，切取目的条带并得到纯化产物，该纯化产物即为DNA单链次级文库；（5）重复筛选：将步骤（4）中的DNA单链次级文库作为筛选库，进行步骤（2）中的筛选，并重复步骤（2）~（4）或干次；（6）阴性筛选：在进行一轮筛选后，在第二轮筛选开始加入阴性筛选步骤，该筛选过程为，将步骤（4）得到的DNA单链次级文库加入仅包被牛血清白蛋白的96孔聚苯乙烯板中孵育1h，将未结合的DNA作为单链DNA筛选库进行步骤（2）中的筛选；（7）多轮筛选：在经过若干轮步骤（2）~（6）筛选后，将最后一轮筛选进行到步骤（3）后将产物进行测序。上述筛选方法中，两次PCR的扩增条件优选为：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃15s，经10轮循环后72℃5min（退火温度和循环数可在PCR前进行优化，选用无特异性扩增且条带明亮的条件）。不对称PCR的前向和后向引物比例优化也可在扩增之前进行，选出目的条带明显的引物比例。本发胆将蛋白质包埋在聚苯乙烯96孔板或其它吸附蛋白质的器皿表面，加入ssDNA文库孵育，洗去游离序列后，用胰蛋白酶消化蛋白-ssDNA复合物，分离复合物，通过煮沸灭酶并释放ssDNA。本方法可以大幅提高对核酸适配体富集。该方法能够保留更多与靶标蛋白结合的ssDNA，提高了蛋白质核酸适配体筛选中适配体的富集量。与现有技术相比，本专利技术的优点具体表现在：（1）与传统蛋白质核酸适配体筛选方法相比，本筛选方法无需对筛选文库和PCR引物进行修饰，在节约成本的同时不会对靶标结构有任何改变，从而增加了筛选出的适配体的特异性；（2）本筛选方法用胰蛋白酶实现蛋白质与其结合寡核苷酸的分离，相比于已见报道的用尿素的方法，该方法能够更好的实现核酸适配体的富集，让尽可能多的有亲和力的适配体得以保留。（3）与传统抗体相比，本专利技术筛选出的适配体优点在于：无免疫源性、分子量小、可体外合成、稳定性高、易于保存。（4）本专利技术可用于以蛋白为靶标的核酸适配体筛选，筛选得到的核酸适配体可以用于各类蛋白质的检测，筛选所得的核酸适配体的特异性高，亲和常数达到ng水平。（5）本专利技术方法可以使与蛋白特异性接合的ssDNA被富集，提高了筛选效率，筛选得到的适配体的亲和力高。用于以蛋白质为靶标的核酸适配体筛选。附图说明图1为本专利技术的实施例中胰蛋白酶与尿素对蛋白-寡核苷酸复合物分离数量对比图；图2为本专利技术的实施例中以四种蛋白为靶标筛选的适配体测序结果中前五条序列富集所占比例分析图；图3为本专利技术实施例中利用SigmaPlot软件拟合的HP-Ag的核酸适配体的亲和力检测结果；图4为本专利技术实施例中利用SigmaPlot软件拟合的CEA的核酸适配体的亲和力检测结果；图5为本专利技术实施例中利用SigmaPlot软件拟合的CA199的核酸适配体的亲和力检测结果。图6为本专利技术实施例中利用SigmaPlot软件拟合的CA125的核酸适配体的亲和力检测结果；图7为本专利技术实施例中利用IDTOligonanlyzer3.1模拟的蛋白HP-Ag的核酸适配体的二级结构；图8为本专利技术实施例中利用IDTOligonanlyzer3.1模拟的蛋白CEA的核酸适配体的二级结构；图9为本专利技术实施例中利用IDTOligonanlyzer3.1模拟的蛋白CA199的核酸适配体的二级结构。具体实施方式以下结合说明书附图和具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质核酸适配体的筛选方法，其特征在于：将蛋白质包埋在聚苯乙烯96孔板或其它吸附蛋白质的器皿的表面；加入胰蛋白酶或蛋白酶消化降解蛋白质，使蛋白质与寡核苷酸结合复合物脱离容器表面，通过加热灭活蛋白酶并释放ssDNA；与蛋白特异性接合的ssDNA被富集，筛选得到亲和力高的适配体。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质核酸适配体的筛选方法，其特征在于：将蛋白质包埋在聚苯乙烯96孔板或其它吸附蛋白质的器皿的表面；加入胰蛋白酶或蛋白酶消化降解蛋白质，使蛋白质与寡核苷酸结合复合物脱离容器表面，通过加热灭活蛋白酶并释放ssDNA；与蛋白特异性接合的ssDNA被富集，筛选得到亲和力高的适配体。2.根据权利要求1所述的核酸适配体筛选方法，其特征在于，其具体步骤如下：将蛋白分子包被在96孔聚苯乙烯板中，采用BSA或FBS封闭，再将寡核苷酸序列ssDNA加到包被蛋白的板孔中孵育一定时间，用缓冲液将未结合的寡核苷酸序列去除后，用胰蛋白酶稀释液消化96孔聚苯乙烯板中的蛋白-寡核苷酸复合物，再将全部溶液体系在沸水中煮沸至使蛋白变性；通过12000g离心20min除去沉淀来去除蛋白残留；采用PCR富集次级文库，利用不对称PCR及变性聚丙烯酰胺凝胶切胶来制备和纯化寡核苷酸单链；循环以上步骤7-10次后可得到富集的核酸适配体。3.根据权利要求1所述的核酸适配体筛选方法，其特征在于，该筛选方法包括以下步骤：（1）合成碱基长度在60-120nt的随机ssDNA文库和20nt的两条引物；随机文库：5’-AACTACGCTCAGACAGACAC-（20-80）N-CTGTGATGCGACTATCTGAG-3’；5’引物：5’-AACTACGCTCAGACAGACAC-3’3’引物：5’-CTCAGATAGTCGCATCACAG-3’（2）筛选：将蛋白用蛋白质包被液稀释并包被在96孔聚苯乙烯板中，37℃缓慢振荡2h，移出溶液并PBS洗涤3次，加入等体积的牛血清白蛋白封闭，37℃缓慢振荡1h，用PBS-T即含有0.05％（v/v）Tween-20的PBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑军，吕明生，闫婉丽，房耀维，刘姝，陈丽，谷利德，
申请(专利权)人：淮海工学院，江苏省海洋资源开发研究院连云港，
类型：发明
国别省市：江苏,32