一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其应用技术

一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其在检测食品中霉菌和酵母计数方面的应用，属于食品检测技术领域。该测试片从上至下依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板、印刷有方格的底板组成；以上材料耐高温的温度范围为130℃～150℃；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水可溶性凝胶，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布。本发明专利技术使用该种测试片进行食品中霉菌和酵母计数测定，培养基组分能够加快霉菌孢子和酵母菌增殖与菌落形成，并抑制霉菌菌丝蔓延生长，解决了霉菌菌丝扩散生长和酵母菌生长慢导致的菌落覆盖、计数准确性差和所需时间长的技术难题。

【技术实现步骤摘要】
一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其应用
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其在检测食品中霉菌和酵母计数方面的应用。
技术介绍
霉菌和酵母计数测定指标是反映食品卫生质量的重要指标，用来判定食品被污染的程度。霉菌和酵母计数测定是我国饮料、坚果制品、米面制品、糕点类等食品的检测指标，也是食品风险预测和危害评估的重要监测项目。目前GB4789.15《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》采用霉菌和酵母平板计数法，该方法需要进行培养基配制、灭菌、玻璃器皿清洗等工作，程序繁琐，工作量大。微生物测试片类检测产品计数便捷，使用起来只需要样品制备、增殖培养和计数步骤，省去了配制培养基、消毒灭菌和培养器皿的清洗处理等大量辅助性工作，是国内外进行微生物污染计数测定最好的检测产品。现有商业化微生物测试片检测产品中，美国3M公司的PetrifilmTM测试片在世界各地应用广泛，国内北京陆桥科技有限公司等多家企业也相继推出系列国产测试片产品，还有一些测试片处于研发和小范围使用阶段。虽然这些测试片具有方便实用的突出优势，但霉菌和酵母计数测试片尚存在一些关键技术瓶颈需解决。突出问题集中在三个方面：即霉菌菌丝蔓延生长影响计数甚至导致无法计数，霉菌菌落显色颜色深覆盖酵母菌，造成计数结果偏差大；酵母菌生长慢、菌落小，检测周期长；菌落显色不能指示所有霉菌和酵母菌，需要完善，防止漏检。本专利技术针对上述存在问题研制了霉菌和酵母菌计数测试片，采用两种特异性酶底物显色方法，即脂肪酶的特异性显色底物棕榈酸对硝基苯酯和碱性磷酸酯酶的特异性显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯；添加了显色促进因子乙醇、硫酸铜、氯化钙、氯化锌，加快菌落显色，缩短测试片检测时间；通过硫酸镁、磷酸二氢钾和硫酸铁等无机盐的联合使用，控制霉菌菌丝蔓延生长，使菌落大小适中，霉菌和酵母菌均呈色清晰、计数准确。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种操作简单、价格低廉、检测准确的霉菌和酵母计数测试片，该测试片从上至下依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜(如透明度高、无毒无刺激性气味、防水透气的PET硅胶膜，厚度为0.05mm～0.10mm，PET硅胶膜的下表面自身带有粘性)、带有镂空区域的塑料中层板(如硬度较好的聚丙烯(PP)塑料板或PET塑料板，厚度为0.15mm～0.30mm)、印刷有方格的底板(如防水、防渗透的白色铜版纸，厚度为0.10mm～0.20mm；方格的尺寸范围是1cm～2cm×1cm～2cm)组成；以上材料耐高温的温度范围为130℃～150℃；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水(温度范围是20℃～45℃)可溶性凝胶，塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1：1.6～2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布。复配冷水可溶性凝胶组分为：将经研磨后过100～150目标准筛的聚丙烯酸钠和瓜尔胶混合，按聚丙烯酸钠和瓜尔胶的重量和100％计算，聚丙烯酸钠的重量百分含量为15～25％，其余为瓜尔胶。霉菌和酵母计数显色检测培养基重量组份为：蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，乙醇4～10mL，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，硫酸镁2～6g，磷酸二氢钾0.3～1.0g，硫酸铁0.3～1.0g，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)0.1～0.4g，棕榈酸对硝基苯酯0.1～0.4g，氯霉素0.05～0.2g和蒸馏水1000mL。以灭菌无纺布作为显色检测培养基的载体，其规格为密度50～80g/m2的水刺无纺布。本专利技术另一个目的是提供上述霉菌和酵母计数测试片的制备方法，其步骤如下：(1)霉菌和酵母计数显色检测培养基的制备称取蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，乙醇2～8mL，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，硫酸镁2～6g，磷酸二氢钾0.3～1.0g，硫酸铁0.3～1.0g，氯霉素0.05～0.2g，加入蒸馏水900mL，经121℃高温灭菌15～20min，得到液体培养基；用100mL蒸馏水将0.1～0.4g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)溶解，用孔径0.22μm的一次性过滤器过滤除菌；用2mL乙醇将0.1～0.4g的棕榈酸对硝基苯酯溶解；将这两种溶液加入到灭菌后的液体培养基中，得到混合液体培养基；将厚度0.10mm～0.20mm、密度50～80g/m2的灭菌无纺布充分浸泡在混合液体培养基中，浸泡的时间为15min～30min，再于无菌、45℃～50℃条件下烘干，得到含有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布；(2)复配冷水可溶性凝胶的制备将经研磨后过100～150目标准筛的聚丙烯酸钠和瓜尔胶混合，得到复配冷水可溶凝胶粉末，其中聚丙烯酸钠的重量百分含量为15～25％；(3)霉菌和酵母计数测试片的制备将透明塑料上层膜、塑料中层板和印刷有方格的底板剪裁成相同尺寸(长度9～12cm，宽度8～10cm)，用聚丙烯酸树脂压敏胶(透明、无毒、无味、无菌)将贴有标签的一侧封闭粘合，粘合宽度为4～6mm；将上述复配冷水可溶凝胶粉末均匀地涂在透明塑料上层膜的粘性下表面上，厚度为0.10mm～0.20mm；在塑料中层板镂空区域露出的底板上均匀涂覆聚丙烯酸树脂压敏胶，厚度为0.05mm～0.10mm，将浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布放在塑料中层板的镂空区域内并压实；进行真空包装，然后采用环氧乙烷灭菌法进行灭菌，从而得到霉菌和酵母计数测试片。(3)测试片法霉菌和酵母菌计数测定的操作步骤固体或半固体样品：称取25g样品(样品可以是米面制品、糕点类食品、坚果制品)，加入225mL无菌稀释液(蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)，充分振摇或用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的稀释匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品(样品可以是饮料)置于盛有225mL无菌稀释液(蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)的容器或无菌均质袋中，充分振摇或用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的稀释匀液。取1mL1：10的稀释匀液加入盛有9mL无菌稀释液的试管中，在漩涡混合器上混匀，得到1：100的稀释匀液；依次制备10倍梯度稀释匀液，备用。根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的稀释匀液，掀开霉菌和酵母菌计数测试片的透明塑料上层膜，取上述样品的稀释匀液1mL加至中层浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布上，使样品稀释匀液均匀分布于整个培养区；将塑料上层膜缓缓落下，避免挤压，静置30s～1min待复配冷水可溶性凝胶与水固化，放入恒温培养箱于25～30℃培养40～50h，按照国家食品安全标准GB4789.15《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行计数。同时，分别取1mL生理盐水作空白对照。本专利技术研制的是霉菌和酵母计数测试片，与同类产品相比，突出特征在于该测试片培养基的组分和用量，该选择性显色培养基由基础营养培养基、无机盐、抑菌剂、显色剂及显色促进因子组成。主要包括3个重要特征。重要技术特征1：本专利技术通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种霉菌和酵母计数测试片，其特征在于：该测试片从上至下依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板、印刷有方格的底板组成；以上材料耐高温的温度范围为130℃～150℃；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水可溶性凝胶，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布；复配冷水可溶性凝胶是将经研磨后过100～150目标准筛的聚丙烯酸钠和瓜尔胶混合，按聚丙烯酸钠和瓜尔胶的重量和100％计算，聚丙烯酸钠的重量百分含量为15～25％，其余为瓜尔胶；霉菌和酵母计数显色检测培养基重量组份为蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，乙醇4～10mL，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，硫酸镁2～6g，磷酸二氢钾0.3～1.0g，硫酸铁0.3～1.0g，5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚磷酸酯0.1～0.4g，棕榈酸对硝基苯酯0.1～0.4g，氯霉素0.05～0.2g和蒸馏水1000mL。

【技术特征摘要】
1.一种霉菌和酵母计数测试片，其特征在于：该测试片从上至下依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜、带有镂空区域的塑料中层板、印刷有方格的底板组成；以上材料耐高温的温度范围为130℃～150℃；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水可溶性凝胶，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布；复配冷水可溶性凝胶是将经研磨后过100～150目标准筛的聚丙烯酸钠和瓜尔胶混合，按聚丙烯酸钠和瓜尔胶的重量和100％计算，聚丙烯酸钠的重量百分含量为15～25％，其余为瓜尔胶；霉菌和酵母计数显色检测培养基重量组份为蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，乙醇4～10mL，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，硫酸镁2～6g，磷酸二氢钾0.3～1.0g，硫酸铁0.3～1.0g，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯0.1～0.4g，棕榈酸对硝基苯酯0.1～0.4g，氯霉素0.05～0.2g和蒸馏水1000mL。2.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母计数测试片，其特征在于：透明塑料上层膜为透明度高、无毒无刺激性气味、防水透气的PET硅胶膜，厚度为0.05mm～0.10mm，PET硅胶膜的下表面自身带有粘性。3.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母计数测试片，其特征在于：塑料中层板为硬度较好的聚丙烯塑料板或PET塑料板，厚度为0.15mm～0.30mm。4.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母计数测试片，其特征在于：底板为防水、防渗透的白色铜版纸，厚度为0.10mm～0.20mm。5.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母计数测试片，其特征在于：无纺布为为密度50～80g/m2的水刺无纺布。6.如权利要求1所述的一种霉菌和酵母计数测试片，其特征在于：塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与中层板面积的比例范围为1：1.6～2.7。7.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈萍，刘桐，任大勇，徐琳琳，董娜，刘爽，修琳，毕云枫，崔雯雯，郑慧纹，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22