人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法技术

本发明专利技术公开了一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，包括：(1)将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；(2)向人参总皂苷提取液中加入β‑葡萄糖苷酶BglPm，a‑L‑阿拉伯呋喃糖酶Abf22‑3，β‑葡萄糖苷酶Bgp1或a‑L‑阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物。本发明专利技术通过向人参总皂苷提取液中加入β‑葡萄糖苷酶，a‑L‑阿拉伯呋喃糖酶，β‑葡萄糖苷酶或a‑L‑阿拉伯吡喃糖苷酶中的任何一种或多种酶进行生物转化，显著提高了人参稀有皂苷Rg3的转化效率，本发明专利技术生物转化方法对于环境友好、转化效率高、适合规模化生产应用。

【技术实现步骤摘要】
人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法
本专利技术涉及人参稀有皂苷Rg3的制备方法，尤其涉及人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，属于人参稀有皂苷Rg3的制备领域。
技术介绍
Rg3是一种四环三萜皂苷，其分子结构式如图2所示，分子式为C42H72O13，分子量为784.3，其最早是由日本学者北川勋在1980年制备和确定其分子式，并提出人参皂苷Rg3具有选择性抑制肿瘤细胞浸润和转移的作用。在已经发现的180多种皂苷中，人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rc等占了皂苷总量的50％以上，而被称为稀有人参皂苷的Rg3只占人参干重的0.015％。现有的人参稀有皂苷Rg3的制备方法多不同程度的存在转化效率低、耗时长、成本高等缺陷，亟待改进。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种生物转化的方法，将总皂苷中的原人参二醇型皂苷高效转化为人参稀有皂苷Rg3；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，包括：(1)将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；(2)向人参总皂苷提取液中加入β-葡萄糖苷酶BglPm，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，β-葡萄糖苷酶Bgp1或a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物。本专利技术通过实验发现，步骤(2)中将a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3和β-葡萄糖苷酶Bgp1组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率高达11.39％，显著的高于其它两种酶的组合；另外，在a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3和β-葡萄糖苷酶Bgp1组成的酶混合物基础上再增加BglPm或Bgp2也能在一定程度上提高Rg3得率。本专利技术进一步的发现，将β-葡萄糖苷酶Bgp1和a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率高达10.64％；将β-葡萄糖苷酶Bgp1和β-葡萄糖苷酶BglPm组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率也达到了4.68％。其中，由β-葡萄糖苷酶BglPm、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2组成的酶混合物进行生物转化时，酶的用量配比没有特别的要求，按照任何一种用量进行配比均能达到较好的转化效果；作为一种优选的实施方式，两种酶进行组合时，二者的用量配比优选是1:1；三种酶进行组合时，三者的用量配比优选是1:1:1。至于人参总皂苷提取液的提取方法是本领域人员所习知，可以采用各种常规的提取方法，例如水提、醇提等各种常规的提取方法，均能适用于本专利技术。其中，所述的生物转化的反应温度可以是28-45℃，优选为30-45℃，最优选为40℃；为了实现更好的转化效果，可以将反应体系在震荡的情况下进行生物转化，所述的转化反应时间可以是4-48小时，优选为8-24小时，更优选为12h。为了达到更好的转化效果，步骤(2)中优选将人参总皂苷提取液进行纯化后再加入β-葡萄糖苷酶BglPm，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，β-葡萄糖苷酶Bgp1或a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化；所述的纯化方法可以本领域的各种常规的纯化方法，例如可以用大孔树脂柱进行纯化，作为一种具体的实施方式，可采用D101大孔树脂柱进行纯化，该纯化方式为本领域技术人员所习知。本专利技术中所用到的β-葡萄糖苷酶BglPm可以是任何一种来源的β-葡萄糖苷酶，都可适用于本专利技术；作为一个具体的实施方式，所用到的β-葡萄糖苷酶BglPm可以是来自芽孢杆菌PaenibacillusmucilaginosusKCTC3870T的β-葡萄糖苷酶BglPm，其基因全长序列包含1,260bp(SEQIDNo.1)，编码419个氨基酸(GenBankaccessionnumber：AEI42200)(SEQIDNo.3)，分子量大小约48kDa，属于糖苷酶家族1(GH1)，可以特异水解原人参二醇型(protopanaxadiol-type，PPD型)皂苷(如图1所示)的C3位和C20位连接的外侧葡萄糖糖基。本专利技术中所用到的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3可以是任何一种来源的a-L-阿拉伯呋喃糖酶，都可适用于本专利技术；作为一个具体的实施方式，所用到的来自于明串珠菌属Leuconostocsp.22-3的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，其基因全长序列包含1,527bp(SEQIDNo.4)，编码508个氨基酸(GenBankaccessionnumber：AFD62907)(SEQIDNo.6)，分子量大小约58.5kDa，属于糖苷酶家族51(GH51)，能特异水解PPD型皂苷的C20位的阿拉伯呋喃糖基。本专利技术中所用到的β-葡萄糖苷酶Bgp1可以是任何一种来源的β-葡萄糖苷酶Bgp1，都可适用于本专利技术；作为一个具体的实施方式，所用到的来源于酯香微杆菌MicrobacteriumesteraromaticumKACC16318的β-葡萄糖苷酶Bgp1，其基因长度2,496bp(SEQIDNo.7)，编码831个氨基酸(GenBankaccessionnumber:AEX88466)(SEQIDNo.9)，分子量大小约88kDa，属于糖苷酶家族3(GH3)，能特异性水解C20位葡萄糖基。本专利技术中所用到的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2可以是任何一种来源的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2，都可适用于本专利技术；作为一个具体的实施方式，所用到的来源于酯香微杆菌MicrobacteriumesteraromaticumGS514的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2，其基因全长2,430bp(SEQIDNo.10)，编码809个氨基酸(GenBankaccessionnumber：AFC90218)(SEQIDNo.12)，分子量大小约87kDa，属于糖苷酶家族2(GH2)，能特异水解C20位的阿拉伯吡喃糖基。本专利技术中所用到的这些酶可以通过商业途径购买得到，也可采用基因工程的方法采用原核表达或真核表达的方法制备得到。为了提高β-葡萄糖苷酶BglPm基因、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2在大肠杆菌中的表达效率，本专利技术对β-葡萄糖苷酶BglPm的原始基因(SEQIDNo.1)、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3的原始基因(SEQIDNo.4)、β-葡萄糖苷酶Bgp1的原始基因(SEQIDNo.7)以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2的原始基因(SEQIDNo.10)分别进行了优化，优化后的β-葡萄糖苷酶BglPm的基因序列为SEQIDNo.2所示，优化后的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3的基因序列为SEQIDNo.5所示，优化后的β-葡萄糖苷酶Bgp1的基因序列为SEQIDNo.8所示，优化后的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2的基因序列为SEQIDNo.11所示；本专利技术通过实验发现，优化后的基因在大肠杆菌中的表达效率有了显著提升。为了进一步提升β-葡萄糖苷酶BglPm基因、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2在大肠杆菌中的表达效率，本专利技术对β-葡萄糖苷酶BglPm基因、a-L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，其特征在于，包括：(1)将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；(2)向人参总皂苷提取液中加入β‑葡萄糖苷酶BglPm，a‑L‑阿拉伯呋喃糖酶Abf22‑3，β‑葡萄糖苷酶Bgp1或a‑L‑阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物。

【技术特征摘要】
1.一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，其特征在于，包括：(1)将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；(2)向人参总皂苷提取液中加入β-葡萄糖苷酶BglPm，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，β-葡萄糖苷酶Bgp1或a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物。2.按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，步骤(2)中向人参总皂苷提取液中加入由a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3和β-葡萄糖苷酶Bgp1组成的酶混合物进行生物转化。3.按照权利要求2所述的生物转化方法，其特征在于，所述的酶混合物中还含有β-葡萄糖苷酶BglPm。4.按照权利要求2所述的生物转化方法，其特征在于，所述的酶混合物中还含有a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2。5.按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，步骤(2)中向人参总皂苷提取液中加入由β-葡萄糖苷酶Bgp1和a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2组成的酶混合物进行生物转化。6.按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，步骤(2)中向人参总皂苷提取液中加入由β-葡萄糖苷酶Bgp1和β-葡萄糖苷酶BglPm组成的酶混合物进行生物转化。7.按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，所述的生物转化的反应温度是28-45℃，所述的转化反应时间是4-48小时；所述的生物转化是在震荡的条件下进行转化反应；优选的，所述的生物转化的反应温度为30-45℃；所述的转化反应时间是8-24小时；更优选的，所述的生物转化的反应温度为40℃；所述的转化反应时间是12小时。8.按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，所用到的β-葡萄糖苷酶BglPm来自芽孢杆菌PaenibacillusmucilaginosusKCTC3870T的β-葡萄糖苷酶BglPm，其基因序列为SEQIDNo.1所示，其氨基酸序列为SEQIDNo.3所示；所用到的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3来自于明串珠菌属Leuconostocs...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宇，李玉花，吴昊，曹领改，尚艳茹，李方远，
申请(专利权)人：东北林业大学，李玉花，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23