一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：清洗吐沙的步骤、收集体腔液的步骤、超声破碎的步骤、离心过滤的步骤、酶解的步骤，得到方格星虫体腔液目标抗菌肽。本发明专利技术通过超声波技术、酶解相结合的集成技术，利用低超声波处理裂解获取其胞内蛋白质，提供一种温和高效的细胞破碎工艺，为后续大量制备该蛋白水解提取提供便利；然后将方格星虫体腔液通过蛋白酶进行酶解，通过控制酶解的时间、温度、加酶量，获取具有高抑菌性的抗菌肽。

【技术实现步骤摘要】
一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法
本专利技术涉及一种有效成分提取技术，尤其涉及一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法。
技术介绍
抗菌肽是指存在于生物体内，能抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的1类小分子多肽。抗菌肽具有广谱抗菌特性，特别是对多重耐药菌具有杀伤作用。其拥有与抗生素不同作用机制，细菌不易对其产生耐药性；滥用抗生素导致的多重耐药菌问题已经成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题，研发一种天然无污染、高效且安全的抗菌药物是一项重要的发展方向，对缓解多重耐药菌蔓延以及降低耐药菌感染导致的死亡具有重要意义。方格星虫(Sipunculusnudus)俗称沙虫、光裸星虫、沙肠子，是一种海洋底栖无脊椎动物，久居滩涂一带沙泥底质的海域；一般盛产于广东湛江及北部湾的北海市等地。星虫肉质脆嫩，味道鲜美，营养丰富，富含蛋白质、脂肪和钙、磷、铁等多种营养成分，具有较高药用功效和食疗价值。据记载，沙虫性寒、味甘、咸，具有滋阴降火、清肺补虚及补肾养颜等功能，可治疗骨蒸潮热、阴虚盗汗、肺虚喘咳、胸闷痰多及妇女产后乳汁稀少等症，对治疗肝炎、肺痨咳嗽、神经衰弱与小儿脾虚等症均有效果。研究表明，星虫的体腔液中含有多肽、多糖等丰富的营养成分，具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等功效。但目前星虫仅主要以鲜食和干制加工为主，而体腔液部分在食用过程中基本被丢弃，极易造成资源浪费。国内外对方格星虫的研究主要集中在形态解剖学特征、繁殖生物学及生理生化等方面。目前，尚未发现有关从星虫体腔液中提取抑菌物相关研究的报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：清洗吐沙的步骤：挑选新鲜生命力旺盛的方格星虫，用除菌海水清洗后；将方格星虫喂养于淡盐水中，每隔1h换水喂养，待方格星虫吐尽泥沙；收集体腔液的步骤：将吐尽泥沙的方格星虫取出，用无菌水冲洗，用滤纸吸收体表多余水分，持镊子夹住星虫前段，使之垂直于消毒离心管中，在虫体末端剪一小口，使体液自然流出，逐条收集；超声破碎的步骤：将收集的体腔液进行超声破碎裂解；离心过滤的步骤：再将超声处理后的体腔液离心，用醋酸纤维膜过滤除菌，放入-20℃冰箱保存，得到体腔液蛋白粗提物；酶解的步骤：将体腔液蛋白粗提物分别采用蛋白酶酶解，进行酶解后，酶解液放入沸水中灭酶，将酶解液离心，收集上清液，冷冻干燥，得到方格星虫体腔液目标抗菌肽。进一步地，在清洗吐沙的步骤中，所述淡盐水的质量浓度为24‰。进一步地，在超声破碎的步骤中，所述超声破碎的条件为：超声波温度为20-30℃、超声波频率为37-53kHz、超声波功率60-100W、超声波时间1-3min。进一步地，在离心过滤的步骤中，所述离心的条件为：在4℃、3000-6000r/min条件下离心10-30min。进一步地，在离心过滤的步骤中，所述醋酸纤维膜的膜孔径为0.1-0.22μm。进一步地，在酶解的步骤中，所述蛋白酶选自酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或两种以上的混合物。进一步地，在酶解的步骤中，所述酶解条件为pH2.0-10.0、温度30-50℃、酶解时间为0.5-1.5h，加酶量为250-350U/g。进一步地，在酶解的步骤中，酶解液放入沸水中灭酶10-15min，将酶解液在13000r/min条件下离心10min。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术通过超声波技术、酶解相结合的集成技术，利用低超声波处理裂解获取其胞内蛋白质，提供一种温和高效的细胞破碎工艺，为后续大量制备该蛋白水解提取提供便利；然后将方格星虫体腔液通过蛋白酶进行酶解，通过控制酶解的时间、温度、加酶量，获取具有高抑菌性的抗菌肽。2.本专利技术制得的抗菌肽具有较强抗菌活性，对利用具有抗菌活性的天然动物多肽的新型药物的研制与开发具有特殊意义。3.本专利技术综合利用方格星虫体腔液中抗菌肽不仅提高沙虫的资源利用效率，而且也是优化和改善其产业发展的重要途径。4.本专利技术制备方法操作简单，超声波辅助酶解可以大大提高水解率，缩短水解时间，生产成本低，产品安全，可提高生产企业的经济效益。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：清洗吐沙的步骤：挑选新鲜生命力旺盛的方格星虫，用除菌海水清洗后；将方格星虫喂养于质量浓度为24‰的淡盐水中，每隔1h换水喂养，待方格星虫吐尽泥沙；收集体腔液的步骤：将吐尽泥沙的方格星虫取出，用无菌水冲洗，用滤纸吸收体表多余水分，持镊子夹住星虫前段，使之垂直于消毒离心管中，在虫体末端剪一小口，使体液自然流出，逐条收集；超声破碎的步骤：将收集的体腔液进行超声破碎裂解；超声波温度为20-30℃、超声波频率为37-53kHz、超声波功率60-100W、超声波时间1-3min；离心过滤的步骤：再将超声处理后的体腔液在4℃、3000-6000r/min条件下离心10-30min，用膜孔径为0.1-0.22μm的醋酸纤维膜过滤除菌，放入-20℃冰箱保存，得到体腔液蛋白粗提物；酶解的步骤：将体腔液蛋白粗提物分别采用蛋白酶酶解，酶解条件为pH2.0-10.0、温度30-50℃、酶解时间为0.5-1.5h，加酶量为250-350U/g；进行酶解后，酶解液放入沸水中灭酶10-15min，将酶解液在13000r/min条件下离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得到方格星虫体腔液目标抗菌肽。所述蛋白酶选自酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或两种以上的混合物。其中，各蛋白酶酶解及添加量条件如下表1。表17种蛋白酶的酶解条件及添加量以下是本专利技术具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。实施例1：新鲜的方格星虫进行清洗、喂养后，收集体腔液，经超声波破碎细胞、离心得到体腔液蛋白粗提物，再将其进行酶解制得体腔液抗菌肽；步骤1：挑选新鲜生命力旺盛方格星虫，用除菌海水清洗后；将方格星虫喂养于质量浓度为24‰的淡盐水中，每隔1h换水喂养，待其吐尽泥沙；步骤2：将吐尽泥沙的星虫取出，用无菌水冲洗，用滤纸吸收体表多余水分，持镊子夹住星虫前段，使之垂直于消毒离心管中，在虫体末端剪一小口，使体液自然流出，逐条收集。步骤3：将体腔液进行超声破碎裂解，其中，超声波温度为20-30℃、超声波频率为37-53kHz、超声波功率60W、超声波时间1min；再将处理后的体腔液在4℃、3000r/min条件下离心10min，用0.22μm醋酸纤维膜过滤除菌，放入-20℃冰箱保存，备用。步骤4：在pH值为3.0、温度为40℃、加酶量为300U/g条件下，利用酸性蛋白酶酶解1h得到方格星虫体腔液。步骤5：利用最适蛋白酶对体腔液进行酶解后，酶解液放入沸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：清洗吐沙的步骤：挑选新鲜生命力旺盛的方格星虫，用除菌海水清洗后；将方格星虫喂养于淡盐水中，每隔1h换水喂养，待方格星虫吐尽泥沙；收集体腔液的步骤：将吐尽泥沙的方格星虫取出，用无菌水冲洗，用滤纸吸收体表多余水分，持镊子夹住星虫前段，使之垂直于消毒离心管中，在虫体末端剪一小口，使体液自然流出，逐条收集；超声破碎的步骤：将收集的体腔液进行超声破碎裂解；离心过滤的步骤：再将超声处理后的体腔液离心，用醋酸纤维膜过滤除菌，放入‑20℃冰箱保存，得到体腔液蛋白粗提物；酶解的步骤：将体腔液蛋白粗提物分别采用蛋白酶酶解，进行酶解后，酶解液放入沸水中灭酶，将酶解液离心，收集上清液，冷冻干燥，得到方格星虫体腔液目标抗菌肽。

【技术特征摘要】
1.一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：清洗吐沙的步骤：挑选新鲜生命力旺盛的方格星虫，用除菌海水清洗后；将方格星虫喂养于淡盐水中，每隔1h换水喂养，待方格星虫吐尽泥沙；收集体腔液的步骤：将吐尽泥沙的方格星虫取出，用无菌水冲洗，用滤纸吸收体表多余水分，持镊子夹住星虫前段，使之垂直于消毒离心管中，在虫体末端剪一小口，使体液自然流出，逐条收集；超声破碎的步骤：将收集的体腔液进行超声破碎裂解；离心过滤的步骤：再将超声处理后的体腔液离心，用醋酸纤维膜过滤除菌，放入-20℃冰箱保存，得到体腔液蛋白粗提物；酶解的步骤：将体腔液蛋白粗提物分别采用蛋白酶酶解，进行酶解后，酶解液放入沸水中灭酶，将酶解液离心，收集上清液，冷冻干燥，得到方格星虫体腔液目标抗菌肽。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在清洗吐沙的步骤中，所述淡盐水的质量浓度为24‰。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在超声破碎的步骤中，所述超声破碎的条件为：超声...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹玉坡，李积华，代亚萍，周伟，韩志萍，李亚会，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44