一种多抗除草剂表达载体、转化子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多抗除草剂表达载体、转化子及其应用。该载体含有草甘膦抗性基因G10、多抗除草剂基因ZJ3‑1。由本发明专利技术的植物多基因表达载体转化大肠杆菌可得到含有该质粒的大肠杆菌转化子；转化农杆菌可得到含有该质粒的农杆菌转化子。该农杆菌转化子可用于转化植物，获得抗多种不同类型除草剂的转基因植物。

【技术实现步骤摘要】
一种多抗除草剂表达载体、转化子及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效植物多基因表达载体、含有该载体的转化体及其应用。技术背景草甘膦是一种广谱灭生性除草剂，使用方便且对环境安全，其作用靶标是叶绿体5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶(5-enolpyrulshikimate-3-phosphatesynthase,EPSPS)，该酶可缩合莽草酸-3-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸和无机磷酸，草甘膦可与酶EPSPS的底物磷酸烯醇式丙酮酸竞争性结合而抑制莽草酸合成途径，造成芳香族氨基酸等必需氨基酸的合成受阻，如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等。草甘膦具有杀草谱广、植物吸收快、在土壤中易降解、对人畜和自然环境安全等优良特性，是目前使用量最大的除草剂类型。近十年来，由于转基因抗草甘膦作物大面积推广(例如孟山都的“RoundupReady”玉米、大豆，Syngenta的“GA21”玉米等)，以及草甘膦价格的不断降低，草甘膦的使用量达到了前所未有的程度。然而仅在草甘膦商业化应用的的十年内，就有杂草对草甘膦产生了抗性(GreenandOwen,2011)。目前，越来越多的杂草也进化出草甘膦抗性，严重威胁着草甘膦的高效性和使用寿命。细胞色素P450(CytochromeP450)是一种具有多功能的血红素氧化酶系，广泛存在于动物、植物和微生物体内。因其能与CO结合，形成的复合物在450nm处有一特征吸收峰而得名。P450由多种同工酶组成，可催化多种疏水物质的单加氧活性，增强异源物质的水溶性，使其更容易排除体外。细胞色素P450不仅催化一些具有重要生理功能的内源性物质如激素、萜类、脂肪酸等的生物合成，而且还参与许多外源性物质的代谢，如药物、除草剂、杀虫剂等，从而降低这些物质的毒性。高等植物中存在大量的细胞色素P450酶系，例如在拟南芥基因组中就有超过300个细胞色素Ρ450基因。相比动物细胞色素P450酶系，植物细胞色素P450酶系具有更高的除草剂代谢能力和更严格的底物专一性。1969年Frear等首次发现棉花种子微粒体中的混合功能氧化酶可代谢灭草隆(monuron)，随后大量的研究表明植物细胞色素P450酶系参与了多种除草剂的代谢和解毒作用。例如来自菊芋(Helianthustuberosus)的CYP73A1、CYP76B1、CYP81B1，来源于烟草的CYP81B2和CYP71A11，以及来源于大豆的CYP71A10等都参与了一些磺酰脲类除草剂的解毒作用，如绿麦隆(chlortoluron)和利谷隆(linuron)。2006年，Pan等从水稻中克隆获得了一种细胞色素P450基因CYP81A6，将其转入到拟南芥和烟草中发现，转基因植株对苯达松和磺酰脲类除草剂的抗性显著提高，利用细胞色素P450基因发展抗除草剂转基因农作物将随着进一步的研究具有更为广阔的前景。抗草甘膦作物的大面积种植大大的改变了杂草防治管理系统，使杂草防治更加简单便捷。然而，随着草甘膦不断重复使用，草甘膦原初的高效性被大大的降低了，很多杂草进化出对草甘膦的抗性，以草甘膦为基础的杂草管理体系也正处于濒危状态。因此，挖掘新型的除草剂抗性基因，并将其同已有的抗性基因相结合，培育第二代多抗除草剂转基因作物，对于控制杂草抗性发生并延长草甘膦的使用寿命，实现作物生产体系的可持续发展具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了培育更理想的多抗除草剂作物，提供一种新型高效植物多基因表达载体和含有该载体的转化子及其应用。用携带该载体的工程菌转化植物，并通过筛选可获得高抗多种除草剂的转基因植物。本专利技术采用的技术方案：本专利技术提供一种多抗除草剂表达载体，所述载体同时包含表达抗草甘膦的基因G10的表达框和表达除草剂降解基因ZJ3-1的表达框。进一步，优选本专利技术的多抗除草剂载体是在基本载体pCAMBIA1300的XhoI位点插入抗草甘膦基因G10表达框，同时在MCS位点插入多抗除草剂基因ZJ3-1表达框而构成。进一步，所述述抗草甘膦基因G10核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。进一步，所述抗除草剂基因ZJ3-1核苷酸序列为SEQIDNO:3所示，氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。进一步，本专利技术所述抗草甘膦基因G10表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQIDNO:5所示转录调控区的启动子CaMV35S，SEQIDNO:6所示5’非翻译区(TEV5’UTR)，SEQIDNO:7所示拟南芥转导肽序列CTP，SEQIDNO:1所示抗草甘膦基因G10和SEQIDNO:8所示3’端的CaMV35S终止子。进一步，所述抗除草剂基因ZJ3-1表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQIDNO:9所示转录调控区的启动子CSV，SEQIDNO:3所示多抗除草剂基因ZJ3-1编码序列和SEQIDNO:10所示3’端的NOS终止子序列。本专利技术还提供一种含多抗除草剂表达载体的转化子。本专利技术涉及一种所述多抗除草剂表达载体在转化植物细胞中的应用，所述植物为水稻、大豆、玉米、油菜、棉花、拟南芥。本专利技术的植物多基因表达载体可以是在基本载体pCAMBIA1300的XhoI位点插入草甘膦抗性基因G10表达框，同时在MCS位点插入多抗除草剂基因ZJ3-1表达框而构成。所用的基本载体pCAMBIA1300中含有Ti质粒中T-DNA的左右边界序列(LB和RB)，在该片段中含有两端为XhoI酶切位点的hygromycine抗性基因表达框，在该处用人工合成的、根据双子叶植物密码子偏好的抗草甘膦基因G10表达框(SEQIDNO：11)替换hygromycine抗性基因表达框，同时，该基本载体含有多克隆位点(MCS)，在MCS位点处插入多抗除草剂基因ZJ3-1表达框(SEQIDNO:12)。所得到的植物多基因表达载体命名为p1300-CSV/ZJ3-1-35s/G10，其所携带的抗草甘膦基因为G10，多抗除草剂基因为ZJ3-1，这些基因位于载体的T-DNA左右边界序列LB和RB区域之中。由本专利技术的植物多表达载体转化大肠杆菌TG1可得到含有该质粒载体的大肠杆菌转化子。由本专利技术的植物多基因表达载体转化农杆菌LBA4404可得到含有该质粒的农杆菌转化子。该农杆菌转化子可用于转化植物，获得同时多抗草甘膦、啶嘧磺隆、硝磺草酮、麦草畏等除草剂的转基因植株。本专利技术的植物多基因表达载体转化农杆菌LBA4404得到的含有该质粒载体的农杆菌转化子用于转化大豆、玉米、水稻、油菜、棉花、或拟南芥，以草甘膦为筛选标记进行筛选，可获得同时抗草甘膦、啶嘧磺隆、硝磺草酮、麦草畏等除草剂的大豆、玉米、水稻、油菜、棉花或拟南芥植株。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术是将抗草甘膦基因和ZJP450基因结合在一起使用，获得的转基因植物既可以使用草甘膦除草，又可以使用ZJP450可以降解的除草剂，如啶嘧磺隆、硝磺草酮、麦草畏等除草剂，还可以使用混配的这些除草剂除草。本专利技术转化得到的植株可以为培育新一代转基因抗除草剂作物提供了新的资源，避免同种除草剂的大规模长时间重复使用而导致的杂草抗性的发生，对于延长草甘膦的使用寿命、实现现代农作生产体系的可持续发展具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多抗除草剂表达载体，其特征在于所述载体是在基本载体pCAMBIA1300的XhoI位点插入抗草甘膦基因G10表达框，同时在MCS位点插入多抗除草剂基因ZJ3‑1表达框而构成。

【技术特征摘要】
1.一种多抗除草剂表达载体，其特征在于所述载体是在基本载体pCAMBIA1300的XhoI位点插入抗草甘膦基因G10表达框，同时在MCS位点插入多抗除草剂基因ZJ3-1表达框而构成。2.如权利要求1所述多抗除草剂表达载体，其特征在于所述述抗草甘膦基因G10核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。3.如权利要求1所述多抗除草剂表达载体，其特征在于所述抗除草剂基因ZJ3-1核苷酸序列为SEQIDNO:3所示。4.如权利要求1所述多抗除草剂表达载体，其特征在于所述抗草甘膦基因G10表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQIDNO:5所示转录调控区的启动子CaMV35S，SEQIDNO:6所示5’非翻译区，S...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖珍珍，沈志成，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33