一种人‑15‑羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法及其应用。该构建方法包括如下步骤：以SEQ ID No：4‑5为引物，GenBank登录号NC_3248的SEQ ID No：1为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶Xba I和BamH I对PCR产物和pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得质粒。与现有技术相比，本发明专利技术提供的HPGD在宫颈癌组织中呈现低水平表达，人为过表达宫颈癌细胞的HPGD，能够明显抑制细胞的增殖、迁移能力及恶性程度，因此，HPGD在宫颈癌发病过程中发挥重要作用，可作为诊疗宫颈癌的新的分子标记和药物靶点。
【技术实现步骤摘要】
一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法及其应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法及其应用。
技术介绍
宫颈癌发病率及死亡率在全球女性癌症中分别位居第三及第四位(CA:acancerjournalforclinicians.2015；65(2):87-108)。宫颈癌发生的早期常无任何症状，不易被察觉，而晚期则伴有不规则的阴道流血、骨盆痛、性交痛等症状(Vaccine.2012；30Suppl5:F55-70；PublicHealthGenomics.2009；12(5-6):291-307.)。HaraldzurHausen及其同事在宫颈癌组织中首次检测到HPV16，从而揭示了子宫颈HPV感染与宫颈癌之间的因果联系，为此，Hausen在2008年被授予诺贝尔生理学或医学奖(Internationaljournalofcancer.2012；131(10):2349-2359.)。流行病学上，高危型HPV的持续感染已被确定为宫颈癌发生的关键致病因子(NatRevCancer.2003；3(3):217-226.)。HPV通过编码两种重要的致瘤蛋白E6和E7维持细胞的转化特性(JournalofVirology.2003；77(19):10186-10201.)。E6可以与E6相关蛋白(E6associatedprotein，E6AP)形成复合物，进而与肿瘤抑制基因p53结合使其泛素化并降解，最终促进肿瘤的发生(JInfectDis.2001；183(1):8-15.)。E7可以竞争性结合pRb肿瘤抑制基因，使得与pRb结合的转录因子E2F释放出来，促进细胞周期(InfectAgentCancer.2010；5:19.)。约有99.7％的宫颈鳞状细胞癌是由HPV感染引起的(AAPSJ.2009；11(1):65-77.)，HPV可通过将病毒DNA整合到染色体DNA上(Viruses.2013；5(2):708-731；JVirol.2008；82(24):12565-12568.)，从而使得原癌基因激活至致癌基因或使肿瘤抑制基因失活。其他危险因素基本与性行为有关，包括性交年龄过小、多个性伴侣以及多次分娩等也加速了宫颈癌的发生，这些因素都会增加感染13种高危型HPV的风险(ProcNatlAcadSciUSA.2006；103(5):1522-1527.)。然而，持续的高风险HPV感染不足以使宿主的上皮细胞永生化，宫颈癌的发生常伴随着遗传学的改变(Virology.2009；384(2):400-409.)。HPGD基因编码短链非金属酶脱氢酶蛋白家族的成员，又称15-羟基前列腺素脱氢酶，是前列腺素失活的关键酶(Virology.2003；307(1):1-11)。该酶的主要作用是促进前列腺素代谢，使其失活并转变成生物失活代谢物，例如通过催化前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)氧化成15-酮-前列腺素E2(15-keto-prostaglandinE2，15-k-PGE2)等(PLoSPathog.2009；5(2):e1000318；ExpertOpinBiolTher.2007；7(5):677-689.)。事实上，前列腺素参与了多种生物过程，包括炎症反应、细胞分化和细胞信号传导等(Viruses.2015；7(5):2450-2469.)。HPGD的缺失可导致罕见遗传病如原发性肥大性骨关节病(primaryhypertrophicosteoarthropathy，PHO)和颅骨关节病的发生(BrJCancer.2007；96(9):1320-1323.)。在风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)纤维样滑膜细胞中HPGD呈现低表达(JVirol.1991；65(2):606-612.)，抗关节炎药物羟化氯喹可通过上调HPGD的水平影响RA的发病。进一步，抑制HPGD可以增强小鼠多种器官组织的再生(JGenVirol.1995；76(Pt10):2589-2593)。另外，HPGD是致癌基因前列腺素内源性过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxidesynthase2，PTGS2)的生理拮抗剂，可通过调控炎症反应影响肿瘤的发生(CancerRes.2008；68(20):8249-8259.)。尽管HPGD在肺癌、胃癌、胆管癌和膀胱癌(CancerRes.2004；64(11):3878-3884；FutureVirol.2011；6(1):45-57；TheJournalofbiologicalchemistry.1997；272(32):19633-19636；Oncogene.1996；13(2):427-431.)等多种肿瘤中的表达水平呈现下调，且具有肿瘤抑制活性，并与肿瘤生长、细胞增值侵袭等密切相关，然而其在宫颈癌发病过程中是否发挥作用，目前尚不清楚。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法及其应用。一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶(HPGD)过表达质粒的构建方法，包括如下步骤：以SEQIDNo：4-5为引物，GenBank登录号NC_3248的SEQIDNo：1为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶XbaI和BamHI对PCR产物(即目的基因)和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得质粒。作为改进的是，所述PCR扩增的参数为：95℃预变性3min，然后95℃15s，60℃15s，72℃30s条件下扩增30个循环，最后72℃延伸5min。作为改进的是，所述PCR产物与pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体的体积比为7:1。人-15-羟基前列腺素脱氢酶(HPGD)过表达质粒表达得到的人-15-羟基前列腺素脱氢酶在制备预防或治疗宫颈癌的产品上的应用。有益效果：与现有技术相比，本专利技术提供的HPGD在宫颈癌组织中呈现低水平表达，人为过表达宫颈癌细胞的HPGD，能够明显抑制细胞的增殖、迁移能力及恶性程度，因此，HPGD在宫颈癌发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗宫颈癌的新的分子标记和药物靶点。附图说明图1为基因芯片结果火山示意图，显示3对宫颈癌及癌旁组织中差异表达达2倍以上的基因的分布；图2为Real-timePCR检测HPGD在67对宫颈癌及癌旁组织中的表达示意图；图3为Westernblot验证稳定表达HPGD的不同宫颈癌细胞系构建情况图，(A)宫颈癌HeLa细胞系；(B)宫颈癌SiHa细胞系；图4为过表达HPGD的宫颈癌细胞接种14天后平板克隆的效果图，(A)HeLa细胞平板效果图；(B)SiHa细胞平板效果图；(C)细胞平板克隆形成数结果统计(**P<0.01，***P<0.001)，其中横线条填充的为HeLa细胞，无填充的为SiHa细胞；图5为过表达HPGD的宫颈癌细胞接种12h后Transwell迁移实验效果图，(A)小室底部的HeLa细胞；(B)小室底部的SiHa细胞；(C)迁本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人‑15‑羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法，其特征在于，以SEQ ID No：4‑5为引物，GenBank登录号NC_3248的SEQ ID No：1为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶Xba I和BamH I对PCR产物和pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得质粒。
【技术特征摘要】
1.一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法，其特征在于，以SEQIDNo：4-5为引物，GenBank登录号NC_3248的SEQIDNo：1为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶XbaI和BamHI对PCR产物和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得质粒。2.根据权利要求1所述的人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方...
【专利技术属性】
技术研发人员：李婉，卢春，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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