具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用。本发明专利技术克隆的亚磷酸脱氢酶PtxQ蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。通过遗传转化验证表明，转亚磷酸脱氢酶PtxQ基因的转基因植物明显提高了对亚磷酸脱氢酶活性，转基因植物获得了利用亚磷酸盐的能力。本发明专利技术的基因可在调控作物对亚磷酸盐利用能力中的应用。

【技术实现步骤摘要】
具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
具体涉及具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用，本专利技术通过突变筛选获得高催化活性的亚磷酸脱氢酶，然后利用人工设计和合成适宜于植物表达的PtxQ基因，以人工合成基因转入宿主细胞中，利用转基因技术获得转基因植物材料。本专利技术还涉及利用该基因使植物获得亚磷酸脱氢酶活性和利用亚磷酸盐的能力，在施用亚磷酸的条件下，达到对目标植物的施肥效果。
技术介绍
我国的人均可耕地面积远远低于发达国家，保障国家粮食安全只能通过提高单位面积产量来实现。为了维持单位产量，我国农业生产中化肥和农药的用量极大，且逐年增长。磷是限制我国作物产量的主要因素之一，然而我国的磷肥当季利用率仅在10％—20％左右(程明芳,何萍etal.2010)。磷肥的低利用效率一方面极大地加重了农业生产成本，另一方面大量没有被作物吸收的磷被土壤固定，通过水土流失作用流入附近水域，造成水体的富营养化，破坏生态环境。磷肥的低利用率，主要是由于土壤对磷酸盐的固定效应极强，导致植物可利用的溶解性有效磷不足。为了解决这一问题，上世纪50年代，有学者曾提出以亚磷酸盐作为一种替代磷肥使用。亚磷酸盐作为磷肥的优势有以下三点：(1)亚磷酸盐在土壤中的溶解能力约为磷酸盐的1000倍；(2)亚磷酸盐能被植物有效吸收(ThaoandYamakawa2009)；(3)很多微生物不能利用亚磷酸盐，因此间接提高植物对亚磷酸盐的利用效率。然而，多年研究表明，虽然植物能够有效吸收亚磷酸盐，但是进入植物体内的亚磷酸盐，并不能被代谢和利用，为植物提供磷营养，过量使用反而会抑制植物对磷的利用效率和生长。由于亚磷酸盐能够抑制多数作物病原卵菌及少数真菌，亚磷酸盐也被开发为绿色环保的杀菌剂广泛使用。若能利用亚磷酸盐替代磷酸盐作为磷肥使用，可极大拓展亚磷酸盐的应用空间，真正实现磷肥的“药肥一体化”。现代分子育种技术的发展与亚磷酸脱氢酶的发现使这一设想成为可能。土壤和水系中，存在少量能够利用亚磷酸盐为唯一磷源的微生物。这些微生物编码亚磷酸脱氢酶(PtxD)，将吸收的亚磷酸氧化为磷酸盐，进而进行正常的代谢(MetcalfandWolfe1998,Martinez,Osburneetal.2012)。最近，来自墨西哥科学家LuisHerrera-Estrella等人在拟南芥中超表达一个假单胞菌属来源的PtxD基因后，转基因植物能够直接利用亚磷酸盐为磷源。在碱性缺磷土壤中，施亚磷酸盐的转基因植株与施磷酸盐的野生型植株相比，前者的总生物量高出16％-20％，表明亚磷酸盐作为磷肥使用的潜力巨大(Lopez-ArredondoandHerrera-Estrella2012)。因此，培育能够利用亚磷酸盐的作物，推广“亚磷酸盐代谢作物+亚磷酸盐”生产模式，有望整合亚磷酸盐“施肥、控草、抗病”三重功效，真正实现磷肥的“药肥一体化”，提高作物对磷肥的利用率，从而为降低农业成产成本，保护农业生态环境提供全新的解决策略。通过生物技术在作物中超表达亚磷酸脱氢酶基因，进行分子育种研究有着非常良好的应用前景，但是国内还没有相关的专利和文献报道。目前已报道的亚磷酸脱氢酶活性较低，无法满足作物中的应用需求，因此获得新型的高活性亚磷酸脱氢酶尤为重要。专利技术人前期研究中构建了突变体库，利用高通量体外筛选技术，意外获得一株催化活性显著提高的突变菌株。测序分析结果表明：突变株中的亚磷酸脱氢酶与野生型氨基酸序列相比，其第139位的酪氨酸被色氨酸替代，证实139位点为该酶核心催化位点。进一步对139位点氨基酸进行定点突变饱和突变库构建和体外筛选，发现该位点突变为谷氨酰胺(Q)时活性最高，其催化效率约为野生型的6倍，筛选获得的新基因被命名为PTDH-Q基因。然而，专利技术人通过将该PTDH-Q基因通过构建载体并转入植物后，发现并不能赋予植物亚磷酸脱氢酶活性和亚磷酸盐的利用能力。为了获得具有植物亚磷酸脱氢酶活性的转基因植物，申请人对PTDH-Q基因进行了密码子优化等分子操作，同时通过人工合成了基因序列并命名为PtxQ。通过构建植物表达载体并进行不同植物的转基因，惊奇发现在拟南芥，水稻，玉米和油菜等不同植物中，PtxQ表达量较高的转基因材料均获得亚磷酸脱氢酶的活性，同时转基因植物也能有效利用亚磷酸盐作为唯一磷源。研究表明：重新设计的PtxQ基因酶活更稳定，在转基因植物中具有更好的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有亚磷酸脱氢酶活性的蛋白质及其基因序列，并且利用所述基因对作物进行转基因改良，由此获得的转基因植物能够利用亚磷酸盐作为唯一磷源。本专利技术通过如下技术方案来实现：本专利技术提供了一种亚磷酸脱氢酶蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供一种亚磷酸脱氢酶蛋白基因，该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术还提供一种包含利用上述核酸培育转基因植物的应用。本专利技术还提供一种对亚磷酸脱氢酶进行改造的方法，所述的方法包括利用SEQIDNO：1所示的核苷酸序列转化水稻愈伤组织，再将转化后的愈伤组织通过遗传转化体系再生为完整的转基因植株。进一步，本专利技术提供了一种经过密码子优化的亚磷酸脱氢酶基因PtxQ，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示(1-1008bp)，其对应的氨基酸序列如1-1008bp所示。该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO：2所示，属于亚磷酸脱氢酶基因。本专利技术还提供一种利用PtxQ基因转化水稻的方法，即：提供了含有SEQIDNO：1所示的序列的PtxQ基因的植物表达载体，该表达载体的图谱如图3所示，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的蛋白质。本专利技术还提供了一种利用植物表达载体转化植物，使其获得亚磷酸脱氢酶活性和利用亚磷酸盐作为磷源的方法。实现本专利技术的具体技术步骤如下：(1)人工合成PtxQ基因通过软件进行密码子优化后，人工合成PtxQ基因，通过PCR和无缝克隆等分子生物学技术将PtxQ基因构建到水稻转化表达载体中。构建步骤见图3。具体实施方法见见《具体实施方式》。(2)水稻转基因利用农杆菌介导水稻转基因受体的快速制备方法获得转基因水稻植株。(3)调节PtxQ基因在水稻中的分子鉴定通过转基因超表达PtxQ基因在水稻中的表达，获得超表达的转基因水稻，并通过常用的PCR和RT-PCR等方法检测转基因植株的生物学功能。(4)PtxQ基因功能初步鉴定将所得转基因超表达PtxQ的材料和野生型(非转基因)水稻种子发芽后，培养于水稻液体培养基中，将生长至10天的幼苗在正常生长和供给亚磷酸盐条件下处理两周，测定所有植株的酶活性和生理表型。超表达PtxQ基因之后，转基因水稻材料获得亚磷酸脱氢酶活性，而对照植株(野生型水稻)没有该活性。与此相对应，当只有供应亚磷酸盐时，转基因植株生长良好，而对照植株生长则受到显著的抑制(见图6)。本专利技术的有益效果：磷矿石是开发磷肥最重要的自然资源，磷矿石一种不可再生的自然资源，国际上磷肥价格逐年上涨，磷矿石已经逐渐成为一种战略资源。目前我国是世界第一磷肥进口国，为了应对我国的磷肥危机并且保护生态环境，迫切需要提高作物对磷肥利用效率和培育耐低磷的作物。本专利技术通过转基因技术获得具有亚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种亚磷酸脱氢酶基因PtxQ在作物对亚磷酸盐的利用能力中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种亚磷酸脱氢酶基因PtxQ在作物对亚磷酸盐的利用能力中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种亚磷酸脱氢酶基因PtxQ在作物对亚磷酸盐的利用能力中的应用，其特征在于，该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王创，吴高兵，袁丽丽，刘同同，石磊，徐芳森，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42