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大麦HvALS1基因及其用途制造技术

技术编号:20089101 阅读:64 留言:0更新日期:2019-01-15 08:13
本发明专利技术公开了一种大麦HvALS1基因及其在增强大麦耐铝性中的用途,属于基因工程技术领域。所述大麦HvALS1基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过对大麦HvALS1基因的克隆和分析,结合BSMV‑VIGS基因沉默和农杆菌介导的转基因过表达技术对该基因进行功能验证,BSMV‑VIGS‑HvALS1沉默植株耐铝性减弱,HvALS1转基因过表达植株耐铝性增强,结果表明HvALS1基因与大麦的耐酸铝性密切相关,为大麦耐酸铝育种与生产提供了理论依据和相关基因。

【技术实现步骤摘要】
大麦HvALS1基因及其用途
本专利技术涉及基因工程
,具体涉及大麦HvALS1基因及其在增强大麦耐铝性中的用途。
技术介绍
铝是地壳中含量最高的金属元素,占比约8%(Mannello等,2011)。在中性环境下,土壤中的铝主要以硅酸盐或者氧化物的形式存在,这些存在形态对植物无毒害作用,然而,当外部环境pH小于5.5的时候,化合态的铝会逐渐解离成离子态的Al3+,而这种离子态的Al3+对植物的生长是有毒害作用的,它最显著的毒害症状是抑制植物根系的伸长,进而抑制了植物对水分和养分的吸收(Kochian,1995),从而影响植物整体的生长发育,降低植物产量。因此,Al3+被认为是抑制酸性土壤中作物生产最主要的因素之一(Bose等,2010)。目前,应对酸土毒害最主要的策略是外施石灰来中和土壤酸碱度以及使用耐酸铝品种(Delhaize和Ryan,1995),但是,外施石灰并不总是能经济有效地解决酸土问题,因此,耐酸铝品种的选育被认为是最经济有效的解决酸土问题的策略(Foy,1988)。尽管目前的基因工程技术给我们选育耐酸铝品种提供了技术支持(Delhaize等,2004),但是目前鉴定到的耐铝基因还很少,因此,耐酸铝相关基因的鉴定便成了我们培育耐酸铝品种所面临的主要障碍。为了应对酸铝胁迫,植物自身也形成了许多解毒机制,这其中包括内部的和外部的解毒,在这些机制中,研究的最透彻的就是有机酸的分泌,它能够在根际螯合铝,许多调控有机酸分泌的基因也被鉴定到,比如大麦中的HvAACT1基因(Furukawa等,2007),小麦中的TmALMT1基因(Sasaki等,2004)等,尽管这些外部解毒机制能螯合大部分的铝,但是仍有一部分具有铝进入到了植物内部,因此,植物还有许多内部解毒机制,但是,目前对大麦的内部铝解毒机制的研究仍少有报道。大麦(HordeumvulgareL.)是继玉米、水稻和小麦之后的第四大禾谷类作物,但是大麦对酸铝胁迫极其敏感,这严重限制了大麦在全球许多酸性土壤农业区的种植,因此,我们迫切的需要筛选耐酸铝的种质,挖掘耐酸铝相关基因,以培育耐酸铝大麦品种。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从大麦中克隆得到的具有耐酸铝特性的基因,为培育耐酸铝大麦品种提供相关基因及理论基础。为实现上述目的,本专利技术提供了大麦HvALS1基因,该基因的CDS区核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。大麦HvALS1cDNA来源于青藏高原一年生野生大麦(H.vulgareL.ssp.spontaneum)XZ16、XZ61;栽培大麦Dayton及黄金希望(GoldenPromise)。XZ16,本课题组前期筛选到的青藏高原一年生六棱型野生大麦(耐酸(铝)基因型,戴华鑫等,2013);XZ61,本课题组前期筛选到的青藏高原一年生六棱型野生大麦(酸(铝)敏感基因型);Dayton,国际公认的耐酸铝栽培大麦品种;GP(GoldenPromise,黄金希望),栽培大麦品种,愈伤组织再生能力相对较强,是目前大麦转基因研究的主要材料。该基因CDS区全长1935bp,编码一个644aa的蛋白序列,该蛋白分子量为69.4KDa,等电点pI=8.59。本专利技术还提供了该基因编码的蛋白质,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。蛋白序列比对结果显示与OsALS1存在91.46%的一致性,与高粱SbABCB25的一致性为91.51%,而与TaABCB25的一致性最高,为99.53%。进化树分析结果显示该蛋白与水稻OsALS1和小麦TaABCB25位于同一进化枝上。因此将该基因命名为HvALS1。HvALS1蛋白序列功能域预测分析,结果显示该蛋白含有1个功能域:AAA功能域,同时,该基因具有五次跨膜结构。对照情况下,HvALS1主要在植株的地上部表达,而遭受铝胁迫后,只有植株的根尖部位的表达被显著诱导;对该基因基因进行单独酸、Al、Cd、La的诱导表达,结果显示该基因的表达仅受到Al的诱导,而且在耐铝基因型XZ16中,24小时内该基因表达量随着时间的延长不断增加。本专利技术还提供了一种重组质粒BSMV:HvALS1,包括RNAγ载体以及插入RNAγ载体的NheⅠ位点间的目的基因片段,所述目的基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术将一个262bp的HvALS1基因片段连入RNAγ载体的NheⅠ位点间,建立BSMV-VIGS体系,成功沉默了XZ16中的HvALS1基因。本专利技术利用BSMV-VIGS方法在野生大麦XZ16上验证HvALS1基因功能,结果显示,沉默后大麦的耐铝性显著降低,表现为,与模拟接种BSMV:γ的植株相比,接种BSMV:HvALS1的植株铝处理后根系的再伸长量显著降低,主根根尖部分受到的损伤更加严重,此外,接种BSMV:HvALS1的植株铝处理后根系的铝含量显著提高且桑色素染色结果显示细胞质中的铝荧光强度也显著提高。本专利技术提供了一种重组表达载体,包括原始载体和插入所述原始载体的目标基因,所述目标基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。重组表达载体的构建可采用常规方法,如可采用Gateway系统将HvALS1基因连入表达载体中。所述原始载体为pBract214载体。本专利技术还提供了一种包含所述的重组表达载体的重组转化子。宿主菌为农杆菌AGL1。本专利技术研究表明HvALS1基因过表达增强了大麦的耐铝性,表现为:铝胁迫后,过表达株系的根系再伸长量显著增加,根系的干重也显著增加,同时两个过表达株系细胞质内的铝荧光强度显著降低,表明过表达后分布在细胞质中的铝显著降低,这从另外一方面说明了该基因与大麦耐铝性有重要的关系。这些结果说明该基因过表达后使大麦对酸铝的耐受性显著增强。本专利技术具备的有益效果:本专利技术通过对大麦HvALS1基因的克隆和分析,结合BSMV-VIGS基因沉默和农杆菌介导的过表达对该基因进行功能验证,BSMV:HvALS1转基因植株耐铝性减弱,HvALS1过表达转基因植株耐铝性增强,表明HvALS1基因与大麦的耐酸铝性密切相关。本专利技术为大麦耐酸铝育种与生产提供了理论依据和相关基因。附图说明图1为HvALS1功能域预测图(A)及HvALS1与水稻、玉米、小麦三个物种的ABCB家族基因的进化树分析(B)。图2为HvALS1与水稻OsABCB25、小麦TaABCB25、玉米ZmABCB10氨基酸序列对比。图3为HvALS1基因的表达模式。(A)铝处理和正常条件下的HvALS1基因的组织定位;(B)HvALS1基因在不同条件下的诱导表达;(C)HvALS1基因在基因型XZ16中的时空表达;(D)在基因型XZ16中接种BSMV:HvALS1后的基因表达。图4为BSMV:HvALS1载体构建图、线性化图和体外转录图。(A)BSMV:HvALS1载体构建示意图;(B)RNAγ:HvALS1酶切产物琼脂糖凝胶电泳图;(C)RNAγ:HvALS1线性化琼脂糖凝胶电泳图;(D)RNAγ:HvALS1体外转录琼脂糖凝胶电泳图;其中1是RNAγ:HvALS1,2是RNAγ:HvALS1经MluI酶切,3是RNAγ:HvALS1经NheI酶切,箭头所指为从载体上酶切下来的HvALS1基因片段,4是RNAα经MluI酶切,5是RNAβ经SpeI酶切,本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.大麦HvALS1基因,其特征在于,该基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.大麦HvALS1基因,其特征在于,该基因的CDS区核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的大麦HvALS1基因编码的蛋白质,其特征在于,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.重组质粒BSMV:HvALS1,其特征在于,包括RNAγ载体以及插入RNAγ载体的NheⅠ位点间的目的基因片段,所述目的基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘文星邬飞波曹方彬冯雪戴华鑫张国平
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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