红花CYP75A1基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了红花CYP75A1基因，是以红花花瓣的RNA反转录的cDNA为模板进行编码区序列的扩增，获得序列为1287bp的基因，命名为CtCYP75A1；利用红花CYP75A1基因构建载体转化烟草叶片，经实验表明，CtCYP75A1基因能够促进黄酮的合成，CtCYP75A1基因被抑制后能够降低黄酮含量，在培育高含量黄酮化合物转基因植物方面具有广阔的前景。

【技术实现步骤摘要】
红花CYP75A1基因及其应用
本专利技术属生物工程领域，具体涉及红花CYP75A1基因及其在提高植物黄酮含量中的应用。
技术介绍
红花（CarthamustinctoriusL.）为一年生草本植物，属菊科植物的干燥管状花。红花具有活血通经，去瘀疗伤，宣毒透疹等功效，其主要有效成分为红花黄色素和红花红色素。红花黄色素为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物，不但是很有价值的食用色素，而且具有活血通络、消炎镇痛等功效，在血管性疾病、高血压、糖尿病并发症等发面亦有重要作用。细胞色素P450(cytochromeP450或CYP450，简称CYP450)是一类亚铁血红素。亚铁血红素是硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢，研究表明，CYP450能够参与细胞的多种生理功能，催化内源性物质如脂类、黄酮类、萜类、生物碱类等的生物合成代谢，此外，CYP尤其在黄酮的生物合成中起着至关重要的作用，主要调控花色素等物质的合成，决定合成花色素苷的种类和花的颜色。前人的研究结果也发现，CYP亚家族成员在植物花瓣中能够催化w末端的连续氧化反应，从而影响其次生代谢产物的合成及信号传导。CYP蛋白家族在调控植物生长发育及次生代谢调控方面起着重要作用，关于此方面的研究多集中在玉米、小麦、水稻、大豆等植物上，而在药用植物红花上的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是为提高植物黄酮含量，而提供红花CYP75A1基因。红花CYP75A1基因，其核苷酸序列如序列表SEQNO.1所示；所述的红花CYP75A1基因，它是红花花瓣总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物：CYP75A1R：ATGCTCATTCACTTTGGTAGTTTCYP75A1F：TCACCGAGCACTTAACTTGAC进行PCR扩增获得。一种表达载体，它是在植物表达载体中插入了序列表SEQNO.1所示的核苷酸序列；所述的表达载体为pBASTA。所述的红花CYP75A1基因在培育高含量黄酮化合物转基因植物的应用；所述的植物为烟草。本专利技术提供了红花CYP75A1基因，是以红花花瓣的RNA反转录的cDNA为模板进行编码区序列的扩增，获得序列为1287bp的基因，命名为CtCYP75A1；利用红花CYP75A1基因构建载体转化烟草叶片，经实验表明，CtCYP75A1基因能够促进黄酮的合成，CtCYP75A1基因被抑制后能够降低黄酮含量，在培育高含量黄酮化合物转基因植物方面具有广阔的前景。附图说明图1红花花瓣RNA提取电泳结果图；图2CtCYP75A1基因编码区序列验证电泳图；A:RT-PCR结果；B：菌液PCR；C：酶切图谱；图3红花CtCYP75A1基因植物表达载体的构建图；图4红花CtCYP75A1基因菌液PCR鉴定；图5红花CtCYP75A1基因酶切鉴定图；图6超表达CtCYP75A1基因的转基因植株的黄酮含量对比；图7RNAi干扰表达CtCYP75A1基因的转基因植株的黄酮含量对比。具体实施方式实施例1红花花瓣RNA提取红花（CarthamustinctoriusL.）花瓣RNA提取，提取步骤如下：1)镊子、研钵、研棒和药匙用锡箔纸包好，放在180℃烘箱里干热灭菌4h，备用；2)1.5mL离心管、移液器吸头用0.1％DEPC水处理过夜，然后120℃高压灭菌20min，放置到60℃烘箱中干燥，备用；3)取红花花瓣约100mg，加入液氮迅速研磨至细粉，分装到两个1.5mLEP管中，各加入1mLRNAisoPlus后混合均匀，室温静置5min；4)4℃，12000rpm离心5min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中；5)加入1/5RNAisoPlus体积量的氯仿，振荡，混匀，室温静置5min；6)4℃，12000rpm离心15min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中；7)加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min；8)弃上清取沉淀，向沉淀中加入1mL75%乙醇清洗沉淀，4℃，12000rpm离心5min，此步骤重复一次；9)弃上清保留沉淀，室温晾干；10)RNA-Free水回溶RNA，提取的RNA保存于-80℃备用。11)红花总RNA样品浓度用NanoDrop2000超微量分光光度计(购自Thermo公司)测定；12)用2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度，电泳结束后用核酸染料染色，在紫外凝胶成像系统上拍照，红花花瓣总RNA提取见图1，由图1可以看到28S和18S清晰的两条带，且28S条带的亮度约为18S的2倍。说明RNA提取完整，无降解，可以满足后续试验需要。实施例2第一条链cDNA的合成取-80℃保存的RNA，通过nanogrop检测RNA的浓度，提取的RNA浓度均在1000ng/ul左右；按照反转录试剂盒的操作说明进行cDNA的反转录，反转录反应体系见表1和表2，反转录后的cDNA保存于-20℃冰箱中备用。上述反应体系在PCR仪上进行反应：65℃，5min，迅速至于冰上急冷。反转录反应条件，42℃，55min；70℃，10min；置于冰上冷却，得到cDNA用于后续反应，在-20℃冻存以留备用。实施例3红花CYP75A1基因编码区序列的克隆根据红花基因组测序结果中获得的编码区序列，设计特异性引物：CYP75A1R：ATGCTCATTCACTTTGGTAGTTTCYP75A1F：TCACCGAGCACTTAACTTGAC；进行编码区序列的克隆；以红花花瓣cDNA为模板进行编码区序列的扩增，获得目的基因片段（图2A），PCR总反应体系为50μL，其中：cDNA1μLdNTPMixture8μL10×LABuffer5μLLATaq0.5μLERF1f(10µM)1μLERF1r（10µM）1μLH2O33.5μL；PCR反应条件为：94℃10min，94℃30s，62℃30s，72℃90s，30次循环；经过胶回收连接到克隆载体pEASY-T1（北京全式金生物技术有限公司）上，进一步通过菌液PCR（图2B）和酶切鉴定（图2C），测序结果正确，命名为CtCYP75A1。测得的序列利用DNAMAN软件进行成核苷酸序列编辑和氨基酸序列的推导，在NCBI网站上进行BLAST搜索同源性序列，利用clustalW1.83软件构建系统发育树，ProtParam软件（http://web.expasy.org/）分析编码蛋白的氨基酸序列的组成、相对分子质量、等电点等理化性质；序列分析表明，红花CYP75A1基因为1287bp，其碱基序列如序列表SEQNO.1所示，编码428个氨基酸（序列表SEQNO.2）。实施例4红花CYP75A1基因的植物超表达载体的构建超表达载体构建如下：（1）首先，化学合成两端含BamHI和EcoRI酶切位点的bar基因序列，然后将合成的序列插入pCAMBIA1304（购自pcambia公司）载体中，替换潮霉素抗性基因；用BamHI和EcoRI分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端。获得含有bar抗性标记的植物表达载体，命名为pCAMBIA1304-bar。将该载体和连接有CtCYP75A1序列的pEASY-T1载体（北京全式金生物技术有限公司）用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 红花CYP75A1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.红花CYP75A1基因，其核苷酸序列如序列表SEQNO.1所示。2.根据权利要求1所述的红花CYP75A1基因，其特征在于：它是红花花瓣总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物：CYP75A1R：ATGCTCATTCACTTTGGTAGTTTCYP75A1F：TCACCGAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀明，李海燕，姚娜，董园园，王南，李晓薇，王法微，刘欣，高延妍，刘伟灿，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22