一种许氏平鮋钙网蛋白基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种许氏平鮋钙网蛋白基因及应用，该许氏平鮋钙网蛋白基因为如下(a1)‑(a4)中任一所述的DNA分子：(a1)编码区如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；(a2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；(a4)来源于蒺藜苜蓿并且与(a1)或(a2)或(a3)限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA分子。本发明专利技术具有周期短、操作简单、经济廉价、特异性强等优势，为其他物种CRT基因的扩增提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种许氏平鮋钙网蛋白基因及应用
本专利技术属于基因与生物工程
，具体地说，涉及一种许氏平鮋钙网蛋白基因及应用。
技术介绍
同源克隆技术(Homologybasedcandidategenemethod)是利用某些基因在进化上的保守性，根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA文库或者cDNA进行PCR扩增，再对扩增的产物进行克隆、测序和分析鉴定(吴龙涛.扇贝免疫相关因子基因的克隆与表达分析[D].中国科学院研究生院(海洋研究所),2004.)。RACE(Rapid-amplificationofcDNAends)快速扩增技术是一种基于PCR能够从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5’和3’末端的有效方法，具有周期短、操作简单、经济廉价、特异性强等优势，广泛应用于全长cDNA序列的扩增(①沈元月.RACE技术研究进展与展望[J].生物技术通报,2008,(S1):131–134；②李关荣,鲁成,夏庆友,等.cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良[J].生命科学研究,2003,3:189–197；③罗聪,何新华,陈虎,等.一种高效获取基因5’末端的RACE方法[J].植物生理学报,2011,47:409–414；④邓雪柯,殷建华,曹毅.3种5’RACE技术的比较与优化[J].成都医学院学报,2007,1:20–25.)。CRT基因在脊椎动物和无脊椎动物被大量研究，但在扇贝中未见报道。本研究中，采用同源克隆和RACE技术鉴定了许氏平鲉的CRT基因，命名为SsCRT，多重序列比对分析发现许氏平鲉的钙网蛋白基因与其他物种的钙网蛋白基因具有高度相似性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种许氏平鮋钙网蛋白基因及应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种许氏平鮋钙网蛋白基因，所述基因为如下(a1)-(a4)中任一所述的DNA分子：(a1)编码区如SEQIDNO.1所示的DNA分子；(a2)SEQIDNO.3所示的DNA分子；(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；(a4)来源于蒺藜苜蓿并且与(a1)或(a2)或(a3)限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA分子。本专利技术还公开了一种上述的基因编码的蛋白质。可选地，是如下(b1)或(b2)：(b1)由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由SEQIDNO.2衍生的蛋白质。本专利技术还公开了一种含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。本专利技术还公开了一种许氏平鮋钙网蛋白基因的克隆方法，包括以下步骤：步骤1、提取许氏平鮋DNA；步骤2、许氏平鮋CRT基因的同源克隆；步骤3、采用RACE技术克隆CRT基因的全长序列。可选地，步骤2中的许氏平鮋CRT基因的同源克隆引物包括CRT-F和CRT-R，其序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。可选地，步骤3中的RACE引物包括SsCRT-5’GSPouter、SsCRT-5’GSPinner、SsCRT-3’GSPouter和SsCRT-3’GSPinner，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.7-SEQIDNO.10所示。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术根据CRT基因的保守序列，本专利技术设计了CRT的同源引物，实验证明其同源引物具有高效，特异性强的特点，能够准确快速的扩增许氏平鮋CRT基因的保守序列。2)本专利技术用RACE快速扩增技术高效获得许氏平鮋CRT基因，与其他获得基因序列的技术相比，具有周期短、操作简单、经济廉价、特异性强等优势，为其他物种CRT基因的扩增提供了技术支持。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术SsCRT基因cDNA的核苷酸序列和预测的氨基酸序列；其中，CRT家族重复序列A和B用灰色阴影表示，CRT家族典型特征序列KHEQKIDCGGGYVK和IMFGPDICG用方框表示；终止子TGA用星号表示；信号肽，内质网滞留信号KDEL和用下划线表示；图2是本专利技术SsCRT进化树分析；图3是本专利技术预测SsCRT蛋白的二级结构；图4是本专利技术预测SsCRT蛋白的三级结构模型。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实验材料(1)实验动物：本研究采用的许氏平鮋(Sebastesschlegeli)来自山东青岛养殖场，低温运到实验室，15℃循环水中暂养，一周后用于实验。(2)主要试剂：RNApreppureTissueKit、TIANprepMiniPlasmidKit均购自天根生化科技有限公司；TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit、SMARTTMRACEcDNAamplificationkit均购自TAKARA；simplecloningKit、感受态细胞Trans5α购自北京全式金生物技术有限公司；DNAgelextractionkit、MasterMix均购自北京擎科生物技术有限公司；氨苄青霉素、IPTG均购自北京索莱宝科技有限公司；Agrose、YeastExtraction、Tryptone均购自生工生物工程股份有限公司。实施例1许氏平鮋(Sebastesschlegeli)DNA的提取1、肾脏RNA的提取：RNApreppureTissueKit(TIANGEN)试剂盒提取总RNA，具体步骤如下：(1)匀浆处理：组织10mg左右加入400μl裂解液RL，用研磨杵研磨，磨碎后加入600μlRNase-FreeddH2O和10μl蛋白酶K，混匀后56℃水浴15min，12000rpm，5min，取上清转移至RNase-free的无菌1.5ml离心管中。(2)加入无水乙醇：将0.5倍上清体积的无水乙醇加入到盛有上清的1.5ml离心管中，混匀后转入吸附柱中，放入离心机，12000rpm，离心1min，倒掉废液。(3)加入去蛋白液：吸取350μl去蛋白液RW1加入到吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃掉废液。(4)吸取80μlDNaseⅠ工作液加入到吸附柱中，静置15min后加入350μl去蛋白液，12000rpm，离心1min，倒掉废液。(5)吸取500μl漂洗液RW加入到吸附柱中，静置2min后12000rpm，离心1min，倒掉废液。此步骤重复一次后12000rpm离心2min，弃掉废液，室温静置5min，将残余的漂洗液晾干。(6)吸附柱转入到新的1.5mlRNase-free离心管中，50μlRNase-FreeddH2O滴加到吸附膜的中央部位，室温放置2min，12000rpm，离心2min后得到RNA溶液。(7)RNA质量检测：取1μlRNA溶液，NanoDrop检测所提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种许氏平鮋钙网蛋白基因，其特征在于，所述基因为如下(a1)‑(a4)中任一所述的DNA分子：(a1)编码区如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；(a2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；(a4)来源于蒺藜苜蓿并且与(a1)或(a2)或(a3)限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种许氏平鮋钙网蛋白基因，其特征在于，所述基因为如下(a1)-(a4)中任一所述的DNA分子：(a1)编码区如SEQIDNO.1所示的DNA分子；(a2)SEQIDNO.3所示的DNA分子；(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；(a4)来源于蒺藜苜蓿并且与(a1)或(a2)或(a3)限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA分子。2.权利要求1所述基因编码的蛋白质。3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，是如下(b1)或(b2)：(b1)由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由SEQIDNO.2衍生的蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：王光花，张敏，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37