一种快速提取和检测白斑综合征病毒DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速提取和检测白斑综合征病毒DNA的方法，属于生物技术领域，该方法是利用含有Triton X‑100的碱裂解，将生物样品中的DNA释放出来，获得白斑综合征病毒DNA，再以此为DNA模板，利用环介导恒温扩增的方法检测白斑综合征病毒。本发明专利技术的碱裂解法是专门针对白斑综合征病毒DNA提取及环介导恒温扩增进行方案选择和条件优化，与现有技术相比，本发明专利技术不需要大型仪器设备，可以经济、快速、高效地提取白斑综合征病毒DNA，结合环介导恒温扩增方法，可以实现该病毒在现场及条件受限环境下检测。

【技术实现步骤摘要】
一种快速提取和检测白斑综合征病毒DNA的方法
本专利技术属于核酸提取和分子检测
，具体涉及一种快速提取和检测白斑综合征病毒DNA的方法。
技术介绍
20世纪90年代以来，白斑综合征一直严重威胁着全世界对虾的养殖安全。已被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的疾病之一，我国农业部将其列为一类动物疫病。该病最早在南美白对虾中爆发，给全球该虾养殖业带来巨大的经济损失。近几年，该病在中国十多个省养殖克氏原螯虾中均有爆发，也严重阻碍了该虾产业的发展。因此，该病的防控工作十分重要。现场快速检测白斑综合征病毒有利于防止引进携带大量白斑综合征病毒的虾，也有利于疾病的快速诊断，及时采取合适的防控措施。目前，环介导恒温扩增技术只需要一个简易的恒温设备，1h内可以将核酸扩增到106-109，达到现场检测的需求，已有现成的检测试剂盒。但是，目前缺少耗时短，对试验仪器设备要求低的高效核酸抽提方法，限制了环介导恒温扩增方法在白斑综合征病毒现场检测中推广应用。科研工作者为了满足不同下游试验需求，开发了不少核酸抽提方法，如异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、CTAB抽提法、酶解法等，为了缩短抽提时间和提高效率，这些方法大多数已采用固相纯化的方式，开发成商业化的试剂盒,有的可以与仪器结合实现自动化抽提,从而使抽提过程大为简化，且可以进行大批量操作。这些核酸抽提方法提取的核酸完整度高，杂质少，但是它们对试验仪器均有较高的要求，不适合用于现场检测。碱裂解法和高温水煮法作为常见的快速简便的提取基因组的方法，利用碱性、高温等条件对动植物组织进行处理，使细胞膜溶解、蛋白变性，基因组游离出来。在实际操作中碱裂解法常常结合高温加热使用，加速细胞的裂解。因为在强碱性条件下细胞基因组核酸出现变性，容易断裂，所以，对核酸完整度高的试验一般不用碱裂解法提取核酸。但是双链环状的小质粒在调回pH值的情况下出现复性，核酸不容易断裂，因此，碱裂解法成为当前最为广泛应用的细菌质粒DNA的提取方法。快速碱裂解核酸提取法，减少核酸纯化的步骤，操作大大减化，但与异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、CTAB抽提法、酶解法提取的核酸比，不仅核酸完整性稍差一些，而且存在蛋白、糖、脂等杂质，提取的核酸不适合用于一些对核酸完整性和纯度要求高的试验。环介导恒温扩增片段长度小，为200-300bp，使用的BstDNA聚合酶具有在高浓度DNA扩增抑制剂中扩增的强大性能，因此，快速碱裂解法提取的核酸适合作为环介导恒温扩增模板使用。因提取效率高，速度快，操作简单，不需要大型仪器，快速碱裂解核酸提取法适合用于现场和大规模高通量核酸提取，与环介导恒温扩增法结合使用，实现现场或实验条件受限环境下对白斑综合征病毒进行检测，有利于白斑综合征防控。已有许多提取动植物基因组核酸的碱裂解法，但是用这些方法提取白斑综合征病毒DNA，用环介导恒温扩增检测效率不够高。为此，专利技术人提出了一种简单、高效提取白斑综合征病毒DNA的碱裂解方法，配合环介导恒温扩增方法可以用于现场检测或大规模筛选阳性样品。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种快速提取和检测白斑综合征病毒DNA的方法，以解决现有快速核酸提取方法配合环介导恒温扩增检测效率低的技术问题。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：本专利技术提供了一种快速提取白斑综合征病毒DNA的方法，步骤包括：取携带白斑综合征病毒的生物样品靶组织，破碎，用碱裂解液进行核酸裂解，将生物样品中的DNA释放出来；加入Tris-HCl缓冲液进行酸中和，调节pH至7.8-8.2，静置，取上清，即得到白斑综合征病毒DNA，其中，所述碱裂解液为含有3％以上质量比TritonX-100的碱液。进一步优选地，碱裂解液为浓度300mmol/L的NaOH溶液。进一步优选地，每1g破碎的靶组织中加入4ml的裂解液，在65-100℃环境下裂解10min。进一步优选地，用0.1mol/L的pH6.0的Tris-HCl缓冲液进行酸中和。本专利技术还提供了一种快速检测白斑综合征病毒的方法，步骤包括：取待检测样本，利用上述快速提取白斑综合征病毒DNA的方法提取待检测样本的白斑综合征病毒DNA，获得提取液，以提取液为DNA模板，进行环介导恒温扩增，检测是否含有白斑综合征病毒DNA。进一步优选地，所述环介导恒温扩增的方法为：采用白斑综合征病毒核酸检测试剂盒结合钙黄绿素显色法进行评价，其中：环介导恒温扩增体系为：反应液14μL，625μmol/L钙黄绿素1μL，MnCl21μL(12.5mmol/L)，Bst酶1μL，模板DNA1μL，用ddH2O补足体积至25μL，加上20μL密封液；环介导恒温扩增条件为：63℃恒温扩增60min；最后通过颜色变化判断结果，阳性反应是荧光绿，阴性反应是黄褐色，通过反应颜色的判断，可直接获得结果，不需要进行电泳检测。本专利技术的原理为，TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)为一种非离子型表面活性剂，它能溶解脂质，可用于DNA的快速提取。本专利技术利用含有TritonX-100的NaOH溶液进行处理，不仅可以加速细胞裂解，而且可以增强环介导恒温扩增效率，提高检测灵敏度，实现了白斑综合征病毒DNA的简单、快速的提取和检测。该方法对仪器设备要求低，抽提时间短，灵敏度高，尤其适合现场、实验条件受限的环境下或者大批量筛选阳性样品时使用。本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术方法操作简单，耗时短，20min内完成核酸抽提；2)试剂价格低廉，省略离心步骤，不需要大型仪器设备；3)本专利技术对温度浴不要求特别精确，有利于其在现场检测中推广使用；4)本专利技术碱裂解液加入的试剂TritonX-100，不仅可以加速细胞裂解，而且可以增强环介导恒温扩增效率，提高检测灵敏度。附图说明图1为利用白斑综合征病毒国标GB/T28630的方法检测的13个克氏原螯虾鳃样本nest-PCR第一轮扩增的凝胶电泳结果；图2为第二轮扩增结果；图中，M为分子量MarkerDL2000，P为阳性对照，N为阴性对照。具体实施方式下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。实施例1本实施例提供了一种克氏原螯虾白斑综合征病毒的抽提和检测方法，从用TIANampGenomicDNAKit(离心柱型DP304)抽提，采用白斑综合征病毒国标GB/T28630的方法进行nest-PCR扩增的克氏原螯虾样本中选8个第一轮PCR扩增阳性的样本，5个第一轮PCR扩增阴性，第二轮PCR扩增阳性的样本进行分析，如图1-2所示。1、用两种方法分别提取上述13个克氏原螯虾鳃组织样本中的白斑综合征病毒DNA，包括：方法一：用TIANampGenomicDNAKit(离心柱型DP304)提取克氏原螯虾鳃组织中白斑综合征病毒DNAa.取适量克氏原螯虾的鳃，剪碎，取0.05g剪碎的鳃组织，放置于1.5mLEppendorf管中；b.加200μL缓冲液GA，震荡至彻底悬浮；c.加入20μLProteinaseK溶液，混匀；d.在56℃放置，每20-30min混匀一次，直至组织溶解，简短离心去除管盖内壁的水珠；e本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速提取白斑综合征病毒DNA的方法，其特征在于，步骤包括：取携带白斑综合征病毒的生物样品靶组织，用碱裂解液进行核酸裂解，将生物样品中的DNA释放出来；加入Tris‑HCl缓冲液进行酸中和，调节pH至7.8‑8.2，静置，取上清，即得到白斑综合征病毒DNA，其中，所述碱裂解液为含有3％以上质量比Triton X‑100的碱液。

【技术特征摘要】
1.一种快速提取白斑综合征病毒DNA的方法，其特征在于，步骤包括：取携带白斑综合征病毒的生物样品靶组织，用碱裂解液进行核酸裂解，将生物样品中的DNA释放出来；加入Tris-HCl缓冲液进行酸中和，调节pH至7.8-8.2，静置，取上清，即得到白斑综合征病毒DNA，其中，所述碱裂解液为含有3％以上质量比TritonX-100的碱液。2.根据权利要求1所述的一种快速提取白斑综合征病毒DNA的方法，其特征在于，碱裂解液为浓度300mmol/L的NaOH溶液。3.根据权利要求1所述的一种快速提取白斑综合征病毒DNA的方法，其特征在于，每1g破碎的靶组织中加入4ml的裂解液，在65-100℃环境下裂解10min。4.根据权利要求1所述的一种快速提取白斑综合征病毒DNA的方法，其特征在于，用0.1mol/L的pH6.0的Tris-HCl缓冲液进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红莲，王永杰，张静，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水产研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34