一种从临床样品中快速简便提取核酸的方法技术

本发明专利技术涉及从临床样品中快速简便提取核酸的方法。在临床样品中按比例加入加入十二烷基肌氨酸钠、TCEP、Tris‑HCl、EDTA和糖元，于第一步加热：37‑50℃加热10‑30分钟，再进行第二步加热：60‑70℃加热2‑10分钟即可提取核酸，能够用于PCR和RPA扩增检测病原微生物、基因突变、特异靶标核酸等。该方法无需借助仪器，步骤少，时间短，提高了核酸提取效率。

【技术实现步骤摘要】
一种从临床样品中快速简便提取核酸的方法
本专利技术属于核酸提取领域，具体涉及临床样品中提取核酸的方法。
技术介绍
为了从临床样品中提取核酸，目前绝大数方法需要借助试剂盒和离心机，而且操作繁杂，不适用于家居、野外或者医院操作。现有技术中已有一些探索简便的核酸提取方法，例如，Myhrvoldetal.,(Field-deployableviraldiagnosticsusingCRISPR-Cas13.Science360,444–448,2018)中所采用的方法，其中在样品中添加TCEP，EDTA，提取的RNA通过反转录后，用于RPA。而根据本专利技术人的研究发现上述方法，其不能有效的提取核酸以用于反转录后进行PCR(参见说明书实施例部分提供的对照例)。该方法仅适合于提取RNA，尚不能得知是否能有效提取DNA。此外，在MasakiIshizawaetal.(SimpleprocedureofDNAisolationfromhumanserum.NucleicAcidsResearch,Vol.19,No.20,p5792)提供了一种快速提取样品中DNA的方法，其中需要添加NaI、EDTA、和N-月桂酰肌氨酸钠盐、作为载体的甘油以及Tris-HCl，调pH值为8，于60℃温育15min。该方法也仅适合于提取DNA，尚不能得知是否对提取RNA有效。因此，需要进一步研发能够简便有效提取核酸包括DNA和RNA的方法，而不需要专门的仪器。
技术实现思路
本专利技术目的是针对现有技术的不足，提供操作简单，只需要加入试剂，不用借助仪器就能提取核酸的方法。专利技术人针对上述Myhrvoldetal.中的方法，通过不同浓度的TECP、EDTA对RNA用于RT-PCR扩增的影响的研究，确定其适合的浓度范围，尤其是考虑到更好地从样本中离析核酸，加入十二烷基肌氨酸钠，Tris-HCl和糖元。研究发现，在试剂中添加上述物质，能够大大提高核酸提取效率。本专利技术提供一种从临床样品中快速简便提取核酸的方法，其特征在于在临床样品中加入十二烷基肌氨酸钠、TCEP、Tris-HCl、EDTA和糖元，于第一步加热：37-50℃加热10-30分钟，再进行第二步加热：60-70℃加热2-10分钟即可提取核酸。优选的，加入的TCEP的终浓度为10mM-1M，优选10-100mM，最优选为10mM。优选的，加入的十二烷基肌氨酸钠的终浓度为0.1-0.5％(重量)，优选为0.2-0.4％(重量)，最优选为0.3％(重量)。其中，加入的EDTA终浓度为0.1-2mM，优选0.5-1.5mM，最优选为1mM。其中，加入的Tris-HCl的终浓度为10mM-25mM，优选15-20mM，最优选为15mM。其中，按体系100μl计，加入的糖元的量为2-10μg，优选4-8μg，最优选为5μg。进一步的，第一步加热是于40-45℃，优选42℃，加热15-25min，优选20min。此外，第二步加热是于；62-66℃，优选64℃，加热3-8min，优选为5min。其中，临床样品为血液、血浆、血清、尿液、或唾液，优选为血清。本专利技术通过研究和验证，所提供的核酸提取方法能够有效用于RT－PCR，当然也能用于RPA方法，能够有效提取DNA和RNA。因而，解决了现有技术中存在的不足而提供了只需要加入试剂，不用借助仪器就简便快速提取核酸的方法。附图说明图1不同浓度EDTA和/或TCEP对RT-PCR扩增的影响电泳图。图2从牛血清中提取RNA并反转录扩增电泳图。图3加入十二烷基肌氨酸钠等物质从牛血清中提取RNA并反转录扩增电泳图。图4从牛血清中提取DNA并扩增电泳图。图5从血液和唾液中提取RNA并反转录扩增电泳图。图6从血液和唾液中提取DNA并扩增电泳图。图7已知文献中提取RNA并反转录扩增结果。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步的说明，其不构成对本专利技术的限制。实施例一：TCEP和EDTA对RT-PCR扩增的影响为了研究TCEP和EDTA对RT-PCR扩增的影响，进行了如下实验，以确定最佳的TCEP和EDTA浓度。第一步，在多个PCR管中分别加入9μlRNA；第二步，分别加入终浓度为10mMEDTA，1mMEDTA，0.1mMEDTA；1MTCEP；100mMTCEP；10mMTCEP；10mMEDTA+100mMTCEP；1mMEDTA+10mMTCEP，1mMEDTA+100mMTCEP；第三步，于42℃加热20min；64℃加热5min；第四步，处理后用于反转录和PCR，其PCR后的电泳结果如图1所示。从实验结果可以得知，TCEP试剂含量过高会影响PCR扩增效率。其中可以得出加入的TCEP的终浓度为10mM-100mM，以及加入的EDTA终浓度为0.1-10mM范围内都是可行的，其中TCEP含量过高则会影响后续PCR效率，但最佳的浓度仍然是1mMEDTA和10mMTCEP。实施例二：用1mMEDTA和10mMTCEP从牛血清中提取RNA按照下述步骤提取牛血清中的核酸，并进行反转录和PCR第一步，在2ml离心管中加入100μl牛血清；第二步，加入终浓度为1mMEDTA和10mMTCEP；第三步，于42℃加热20min；64℃加热5min；第四步，提取完成，于95℃处理10min灭活病毒，然后待温度降到室温后，用于后续RT-PCR。RT-PCR反应步骤和反应体系参照TaKaRa公司PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKitVer.2(DyePlus)产品说明书(货号：RR057A)，上游引物序列为5’GGGGAGTCGTCAGTGGTTCG3’，下游引物序列为5’GTGCCATGTACAGCAGAGATT3’。其PCR后的电泳结果如图2所示。实施例三：用1mMEDTA、10mMTCEP后、十二烷基肌氨酸钠和Tris-HCl从牛血清中提取RNA按照与实施例二相同的步骤进行，区别仅在于第二步加入终浓度为1mMEDTA和10mMTCEP后，加入十二烷基肌氨酸钠和Tris-HCl，终浓度分别为0.3％，15mM；再加入5μg糖元。该实施例中同时与实施例二的实验进行了比较实验。其PCR后的电泳结果如图3所示，从条带亮度即可判断，加入十二烷基肌氨酸钠和Tris-HCl有助于从牛血清中提取RNA。实施例四：加入EDTA和TCEP有利于从牛血清中提取DNA按照与实施例三相同的步骤进行(提取核酸后直接进行PCR)，区别仅在于第二步加入0.3％十二烷基肌氨酸钠，15mMTris-HCl，5μg糖元，以及终浓度为1mMEDTA和10mMTCEP。该实施例中同时与第二步中加入0.3％十二烷基肌氨酸钠，15mMTris-HCl，5μg糖元进行了比较实验。其PCR后的电泳结果如图4所示，从条带亮度即可判断，其中加入有1mMEDTA和10mMTCEP有助于从牛血清中提取DNA。实施例五：从血液和唾液中提取RNA按照与实施例三相同的步骤进行提取血液和唾液β-actin基因的mRNA，用于后续反转录和PCR。反转录体系和步骤参照HaiGene公司Golden1stcDNASynthesisKit试剂盒(产品货号：D0401，该产品的gDNARemover组分直接降解去除RNA中残留的基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从临床样品中快速简便提取核酸的方法，其特征在于在临床样品中加入十二烷基肌氨酸钠、TCEP、Tris‑HCl、EDTA和糖元，于第一步加热：37‑50℃加热10‑30分钟，再进行第二步加热：60‑70℃加热2‑10分钟即可提取核酸。

【技术特征摘要】
1.一种从临床样品中快速简便提取核酸的方法，其特征在于在临床样品中加入十二烷基肌氨酸钠、TCEP、Tris-HCl、EDTA和糖元，于第一步加热：37-50℃加热10-30分钟，再进行第二步加热：60-70℃加热2-10分钟即可提取核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入的TCEP的终浓度为10mM-1M，优选10-100mM，最优选为10mM。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入的十二烷基肌氨酸钠的终浓度为0.1-0.5％(重量)，优选为0.2-0.4％(重量)，最优选为0.3％(重量)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入的EDTA终浓度为0.1-10mM，优选0.5-1.5mM，最优选为1mM。5.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张韧，沈赟彬，金帅涛，
申请(专利权)人：浙江天杭生物科技股份有限公司，张韧，
类型：发明
国别省市：浙江,33