一种线粒体DNA提取试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种线粒体DNA提取试剂盒和方法，涉及线粒体DNA提取技术领域。本发明专利技术提供的线粒体DNA提取试剂盒，包括蛋白酶K、悬浮液、裂解液和洗脱液；其中，悬浮液为PBS缓冲液；裂解液含有：Tris‑HCl、NaCl、EDTA、SDS以及RNA carrier；洗脱液含有：Tris‑HCl和EDTA。该线粒体DNA提取试剂盒通过合适的试剂搭配，可以直接以血浆作为样本，从中提取出高质量、高纯度的线粒体DNA，采用该试剂盒所提取出的线粒体DNA可以直接用于荧光定量PCR检测。

【技术实现步骤摘要】
一种线粒体DNA提取试剂盒和方法
本专利技术涉及线粒体DNA提取
，具体而言，涉及一种线粒体DNA提取试剂盒和方法。
技术介绍
众所周知，线粒体(mitochondrion)是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为"powerhouse"。线粒体由外至内可划分为线粒体外膜(OMM)、线粒体膜间隙、线粒体内膜(IMM)和线粒体基质四个功能区。线粒体基质是线粒体中由线粒体内膜包裹的内部空间，其中含有参与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反应的酶等众多蛋白质以及苹果酸脱氢酶。线粒体基质中一般还含有线粒体自身的DNA(即线粒体DNA)、RNA和核糖体(即线粒体核糖体)。线粒体DNA是线粒体中的遗传物质，呈双链环状。一个线粒体中可有一个或数个线粒体DNA分子。正常情况下，因为新城代谢的原因，血液中会有极少量的线粒体DNA存在。但是当组织细胞结构发生破坏，甚至线粒体结构发生破坏时，线粒体内基质物质释放，线粒体DNA会大量释放于血浆中，而且血浆中线粒体DNA的数量与组织细胞的损伤程度有相关性。而现在市面上没有提取血液中的线粒体DNA的试剂盒和方法。故本专利技术解决的就是血浆中线粒体DNA的提取试剂盒和方法。由于线粒体的特殊结构，它不但有类似细胞的双分子层，还有不同于细胞的结构，另外，线粒体DNA结构类似于细菌，与细胞基因组完全不同。美国弗吉尼亚大学最新一项研究表明，动植物细胞中的线粒体其实是寄生细菌，早期寄生细菌可以对动物和植物提供能量，在细胞中作为能量寄生虫存在，对寄居体十分有益。新一代DNA序列技术解码18种细菌基因组，这些细菌是线粒体的近亲生物。所以线粒体DNA的提取也有别于细胞DNA和细菌DNA的提取。另外，从功能上来说，线粒体是半自动细胞器。最新的研究表明线粒体参与细胞老化、细胞凋亡，并在抗艾滋病毒药物的治疗以及癌症发生、发展过程中发挥其作用。线粒体DNA存在很高突变率，这些突变与一些疾病相关，比如糖尿病、老年痴呆症和肌紊乱等。在研究线粒体DNA与疾病的关系时要求线粒体DNA的提取和量化。目前的线粒体DNA提取试剂盒为从多种细胞及组织中提取线粒体DNA提供了一种方便的工具。纯化的线粒体DNA可用于酶切、southernblotting、克隆、PCR分析和扩增。但是获取组织、细胞在临床上是个困难的事情，外周血则容易获得，对于研究来说是更为方便的取材。但是，目前尚无外周血液中提取线粒体DNA的方法。本专利技术提供了一种用于血浆线粒体DNA的提取试剂盒和方法，提取的线粒体DNA可用于各种分子生物学分析。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种线粒体DNA提取试剂盒，该试剂盒可用于对血浆样本中的线粒体DNA。本专利技术的另一目的在于提供一种线粒体DNA的提取方法，该提取方法可从血浆样本将线粒体DNA提取出。本专利技术是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种线粒体DNA提取试剂盒，其包括：蛋白酶K、悬浮液、裂解液和洗脱液；其中，悬浮液为PBS缓冲液；裂解液含有：Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS以及RNAcarrier；洗脱液含有：Tris-HCl和EDTA。其中，蛋白酶K用于溶解膜蛋白，悬浮液用于平衡被提取物质，裂解液含Tris-HCl作为缓冲体系，NaCl作为等渗体系，EDTA作为核酸酶抑制剂，表面活性剂SDS破坏线粒体结构，RNAcarrier即酵母tRNA用于保护核酸。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，裂解液含有：10-55mMTris-HCl、100-200mMNaCl、0.5-5.0mMEDTA、0.5％-2.5％SDS以及0.5-1.5mg/mlRNAcarrier。需要说明的是，在裂解液中：Tris-HCl的浓度可以是10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM和55mM中的任意一者或任意两者之间的范围；NaCl的浓度可以是100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM中的任意一者或任意两者之间的范围；EDTA的浓度可以是0.5mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、4.6mM、4.8mM和5.0mM中的任意一者或任意两者之间的范围；SDS的浓度(质量百分比，g/g)可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％和2.5％中的任意一者或任意两者之间的范围；RNAcarrier的浓度可以是0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml和1.5mg/ml中的任意一者或任意两者之间的范围。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，洗脱液含有：5-10mMTris-HCl和0.08-0.12mMEDTA。需要说明的是，洗脱液中：Tris-HCl的浓度可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM和10mM中的任意一者或任意两者之间的范围；EDTA的浓度可以是0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.11mM和0.12mM中的任意一者或任意两者之间的范围。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，线粒体DNA提取试剂盒还包括：洗涤液1和洗涤液2。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，洗涤液1含有：5M盐酸胍、20mMTris-HCL、以及40％(v/v，ml/ml)无水乙醇，pH6.6。洗涤液1可用于去除蛋白等杂质。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，洗涤液2含有：20mMNaCl、2mMTris-HCL、80％(v/v，ml/ml)无水乙醇，pH7.5。洗涤液2可用于去盐等杂质。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，线粒体DNA提取试剂盒针对的样品为血浆。另一方面，本专利技术提供了一种线粒体DNA的提取方法，其包括：样本处理步骤：用悬浮液悬浮血浆样本经离心后获取的沉淀，得到悬浮线粒体液；消化步骤：往悬浮线粒体液中加入蛋白酶K和裂解液，进行消化，得到消化液；DNA沉淀步骤：往消化液中加入无水乙醇，混匀，室温静置后，获取DNA沉淀；洗涤步骤：用洗涤液洗涤DNA沉淀；洗脱步骤：用洗脱液溶解DNA沉淀，溶解液即为线粒体DNA溶液；其中，悬浮液为PBS缓冲液；裂解液含有：Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS以及RNAcarrier；洗脱液含有：Tris-HCl和EDTA。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，裂解液含有：10-55mMTris-HCl、100-200mMNaCl、0.5-5.0mMEDTA、0.5％-2.5％SDS以及0.5-1.5mg/mlRNAcarrier。需要说明的是，在裂解液中：Tris-HCl的浓度可以是10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM和55mM中的任意一者或任意两者之间的范围；NaCl的浓度可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种线粒体DNA提取试剂盒，其特征在于，其包括：蛋白酶K、悬浮液、裂解液和洗脱液；其中，所述悬浮液为PBS缓冲液；所述裂解液含有：Tris‑HCl、NaCl、EDTA、SDS以及RNA carrier；所述洗脱液含有：Tris‑HCl和EDTA。

【技术特征摘要】
1.一种线粒体DNA提取试剂盒，其特征在于，其包括：蛋白酶K、悬浮液、裂解液和洗脱液；其中，所述悬浮液为PBS缓冲液；所述裂解液含有：Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS以及RNAcarrier；所述洗脱液含有：Tris-HCl和EDTA。2.根据权利要求1所述的线粒体DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有：10-55mMTris-HCl、100-200mMNaCl、0.5-5.0mMEDTA、0.5％-2.5％SDS以及0.5-1.5mg/mlRNAcarrier。3.根据权利要求1或2所述的线粒体DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液含有：5-10mMTris-HCl和0.08-0.12mMEDTA。4.根据权利要求1或2所述的线粒体DNA提取试剂盒，其特征在于，所述线粒体DNA提取试剂盒还包括：洗涤液1和洗涤液2。5.根据权利要求1所述的线粒体DNA提取试剂盒，其特征在于，所述线粒体DNA提取试剂盒针对的样品为血浆。6.一种线粒体DNA的提取方法，其特征在于，其包括：样本处理步骤：用悬浮液悬浮血浆样本经离心后获取的沉淀，得到悬浮线粒体液；消化步骤：往所述悬浮线粒体液中加入蛋白酶K和裂解液，进行消化，得到消化液；DNA沉淀步骤：往消化液中加入无水乙醇，混匀，室温静置后，获取DNA沉淀；洗涤步骤：用...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋勇，胥武剑，尹志强，杨志坚，张洪英，高峰，
申请(专利权)人：宋勇，胥武剑，尹志强，杨志坚，张洪英，高峰，
类型：发明
国别省市：江苏,32