一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用，该突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的14位、323位、344位、449位和510位氨基酸进行单点突变或多点突变获得的。与野生型苏氨酸脱氨酶相比，本发明专利技术苏氨酸脱氨酶具有极高的稳定性，可以大大提高工业化生产中苏氨酸脱氨酶的使用寿命。其中，G323D/F510L/T344A突变体应用于L‑2‑氨基丁酸的生产，可以使L‑苏氨酸转化率达到99％，NAD

【技术实现步骤摘要】
一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及苏氨酸脱氨酶突变体，和产苏氨酸脱氨酶基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。
技术介绍
苏氨酸脱氨酶(Threoninedeaminase，简称TD，EC4.3.1.19)，催化L-苏氨酸脱氨生成α-酮丁酸，是异亮氨酸合成代谢途径的关键步骤。α-酮丁酸是生产L-2-氨基丁酸、异亮氨酸、D-2-羟基丁酸以及正丙醇的重要原材料，尤其是L-2-氨基丁酸，作为治疗癫痫的手性药物左乙拉西坦和布瓦西坦，抗结核药物盐酸乙胺丁醇，以及内皮素抗因子、连氮丝菌素类抗生素的重要前体，受到广泛的关注。目前，已经有苏氨酸脱氨酶应用于L-2-氨基丁酸合成的报道，但其稳定性较差，限制了生物催化剂的使用寿命，限制了催化效率，也增加了工业生产中的成本。因此，提高苏氨酸脱氨酶的热稳定性，并通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌在L-2-氨基丁酸的制备中具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种苏氨酸脱氨酶突变体、编码基因、重组载体、基因工程菌以及在催化L-苏氨酸制备L-2-氨基丁酸中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种苏氨酸脱氨酶突变体，所述突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第14位、323位、344位、449位和510位进行单、双、三或四点突变而成。进一步，所述单突变是将第14位丙氨酸突为苏氨酸(A14T)、第323位甘氨酸突变为天冬氨酸(G323D)、第344位苏氨酸突变为丙氨酸(T344A)、第449位精氨酸突变为半胱氨酸(R449C)、第510位脯氨酸突变为亮氨酸(F510L)；所述双点突变为A14T/G323D、G323D/T344A、G323D/R449C、G323D/F510L；所述三点突变为G323D/F510L/T344A、G323D/F510L/R449C；所述四点突变为G323D/F510L/T344A/R449C。更进一步，所述突变体氨基酸序列为下列之一：SEQID.2，SEQID.3，SEQID.4，SEQID.5，SEQID.6，SEQID.7，SEQID.8，SEQID.9，SEQID.10，SEQID.11，SEQID.12和SEQID.13。本专利技术还涉及一种编码所述苏氨酸脱氨酶突变体的基因。本专利技术还涉及一种携带所述基因的重组载体。本专利技术还涉及一种由所述重组载体转化制备的重组工程菌。本专利技术提供一种所述苏氨酸脱氨酶突变体在催化L-苏氨酸制备L-2-氨基丁酸中的应用。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术构建了一种高效表达苏氨酸脱氨酶突变体的重组大肠杆菌，提高了苏氨酸脱氨酶的热稳定性；该菌株可以用于L-2-氨基丁酸的生产，使脱氢酶法合成L-2-氨基丁酸的转化率达到99％以上，且NAD+的添加量低至0.04g/L，有利于实现脱氢酶法生产L-2-氨基丁酸的工业化。附图说明图1ilvA基因片段核酸电泳图，左侧泳道为DNAMarker，右侧泳道为ilvA基因PCR扩增产物。图2野生型菌SDS-PAGE电泳图，泳道1为破碎液沉淀中蛋白，泳道2为破碎液上清中蛋白，泳道3为全细胞蛋白。图3E.coliK12来源的TD与热稳定蛋白的多重序列对比结果。图4野生型苏氨酸脱氨酶和突变体G323D/F510L/T344A的最适反应温度。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅仅限于此：实施例1：苏氨酸脱氨酶重组菌的构建选取EscherichiacoliK12来源的苏氨酸脱氨酶，利用PCR技术，以E.coliK12基因组为模板，以ilvA-F:5’-GGAATTCCATATGGCTGACTCGCAACCCCTG-3’和ilvA-R:5’-CCGCTCGAGTTAACCCGCCAAAAAGAAC-3’为引物，对苏氨酸脱氨酶进行扩增，并在其5’端和3’端分别引入NdeI和XhoI限制酶切位点。PCR反应体系(50μL)为：5×PrimeSTARGXLbuffer10μL，PrimeSTARGXLDNAPolymerase1μL，2.5mMdNTPs4μL，模板DNA1μL，上下游引物各1μL，无菌水32μL。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，循环30次；68℃延伸10min。以1％琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物，结果扩增到与SEQIDNO.14序列大小相符的ilvA基因片段(图1中泳道1、2)。将纯化后的PCR产物利用pEASY-BluntSimpleCloningKit连接到pEASY-BluntSimple载体上，将重组质粒转入到E.coliDH5α感受态细胞中，通过AmpR和KanR两种抗性的筛选板筛选阳性转化子。挑取阳性转化子以5mLLB培养基培养，提取质粒进行测序。将测序结果与数据库序列进行比对，确保序列克隆正确。将提取的重组质粒pEASY-BluntSimple/ilvA及pET-28a(+)分别用NdeI和XhoI酶切。将酶切产物进行核酸电泳，取pEASY-BluntSimple/ilvA重组质粒酶切后约为1,500bp的片段以及pET-28a(+)酶切产物中约5,300bp的片段进行胶回收，将回收片段用T4连接酶25℃连接20min。将酶连产物转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中：将20μL连接产物加入100μL刚刚解冻的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min，42℃下热击45s，冰浴10min，然后加入250μL灭菌的LB培养基，在37℃，220r/min的摇床中培养1小时。取预培养后的细胞，将EP管在3000×g下离心30min，用移液枪移去清液，然后将沉淀的细胞轻轻吸起，使用涂布法完全转移到含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃下培养10～12h。挑取阳性转化子进行菌落PCR，并提取质粒进行序列测定，得到正确构建的重组质粒pET28a(+)-ilvA。含有pET28a(+)-ilvA的阳性克隆为正确构建的重组E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-ilvA。实施例2：苏氨酸脱氨酶基因的定向进化突变将实施例1中的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-ilvA提取质粒，以质粒pET28a(+)-ilvA为模板，以Primers-F：5’-CGCGGATCCATGGCTGACTCGA-3’，Primers-R：5’-CCCAAGCTTAACCCGCCAAAAAGAAC-3’为引物，以加入二价锰离子和二价镁离子的方式向聚合酶链式反应中引入复制错误。定向进化的PCR反应体系为：5mMMnCl21μL，Taq聚合酶0.5μL，10×buffer10μL，25mMMgCl214μL，dNTPMixture4μL，上下引物各1μL,模板DNA(50ng/μL)0.5μL和无菌水18μL。定向进化的PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，30个循环；72℃10min。纯化PCR产物，使用限制性核酸内切酶BamHI和HindIII在37℃下处理3小时。将“双酶切”处理后的PCR产物使用核酸电泳纯化，割胶回收含有突变位点的较小片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苏氨酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述苏氨酸脱氨酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第14位、第323位、第344位、第449位和第510位的氨基酸进行单、双、三点或四点突变获得。

【技术特征摘要】
1.一种苏氨酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述苏氨酸脱氨酶突变体是将如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第14位、第323位、第344位、第449位和第510位的氨基酸进行单、双、三点或四点突变获得。2.如权利要求1所述的苏氨酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述的突变具体为其第14位丙氨酸突变为苏氨酸、第323位甘氨酸突变为天冬氨酸、第344位苏氨酸突变为丙氨酸、第449位精氨酸突变为半胱氨酸、第510位脯氨酸突变为亮氨酸。3.如权利要求1所述的苏氨酸脱氨酶突变体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建平，王莹，朱力，乔沛，薛海龙，李国四，吴绵斌，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33