一种耐热型氨肽酶及其高产毕赤酵母工程菌制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种耐热型氨肽酶及其高产毕赤酵母工程菌。本发明专利技术筛选获得耐热氨肽酶突变基因A‑2，将A‑2构建到pPIC9质粒上，并转化到毕赤酵母JC308，筛选得到高表达耐热氨肽酶的重组菌P‑2，其摇瓶发酵液氨肽酶酶活可达2200U/mL，较原始氨肽酶提高57.14％。P‑2所表达的耐热氨肽酶在80℃保温处理1h，突变体相对酶活力仍剩余85％左右，90℃处理1h，相对酶活仍存留45％以上，耐热性良好。

【技术实现步骤摘要】
一种耐热型氨肽酶及其高产毕赤酵母工程菌
：本专利技术涉及生物
，具体涉及一种耐热型氨肽酶及高产耐热氨肽酶的毕赤酵母工程菌。
技术介绍
：氨肽酶是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸，使氨基酸逐个游离出来的酶，不仅能水解多肽，而且能水解完整的蛋白质分子。在许多生物中发现了各种性质的氨肽酶。它不仅存在于高等动物的胰脏、肠液中，也广泛分布于多种真菌、细菌和原生动物体内，一些真菌和细菌的种类还能向胞外分泌这种酶。氨肽酶有很多种，不同的氨肽酶对N端氨基酸残基的水解能力表现具有差异性。同一种氨肽酶对不同的N端氨基酸残基的水解能力也不同。根据不同氨肽酶对水解N端氨基酸残基专一性程度的不同，可以将氨肽酶分为两大类：一类氨肽酶对N端氨基酸残基专一性低，能水解几乎所有的氨基酸残基，如亮氨酰氨肽酶(LAP)、赖氨酰氨肽酶(PepN)、苯丙氨酰氨肽酶(PepM)；区分这类氨肽酶可依据它们对不同氨基酸残基的水解速度的快慢，如亮氨酰氨肽酶水解末端亮氨酸残基速度最快，而赖氨酰氨肽酶水解末端赖氨酸残基速度最快。另一类氨肽酶对N端氨基酸残基有严格的专一性，只能特异地水解某一种或几种氨基酸残基，如PepA只能水解天冬酰氨和谷氨酰氨残基；其中包含一类很重要的脯氨肽酶，PepX(水解末端第二位为脯氨酸残基的肽)、PepP(水解末端脯氨酸残基)、PepI(水解末端脯氨酸亚氨基)。由于动植物中的氨肽酶含量低，提取成本高，所以通过微生物发酵生产氨肽酶既高效且低廉。产氨肽酶的微生物的种类很多，细菌、酵母、霉菌中通常都含有一定量的氨肽酶。但各种微生物中氨肽酶的含量和种类有很大的差异。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种耐热性提高的氨肽酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。所述氨肽酶突变体来自一株经紫外诱变获得的枯草芽孢杆菌CA23，将氨肽酶突变体编码基因A-2从CA23中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母JC308中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。在本专利技术中采用如下定义：1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2.氨肽酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Leu181Arg，表示位置181的氨基酸由野生型的Leu替换成Arg，位置的编号对应于SEQIDNo.2中野生型氨肽酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQIDNo.1中野生型氨肽酶的核苷酸序列编号。在本专利技术中，A-1表示野生型氨肽酶的编码基因，A-2表示氨肽酶突变体的编码基因，信息如下表。所述氨肽酶突变体的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.4所示；所述氨肽酶突变编码基因A-2的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示；用于表达所述氨肽酶的表达载体为pPIC9，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母JC308；所述毕赤酵母工程菌是将氨肽酶突变编码基因A-2连接表达载体pPIC9，并在毕赤酵母JC308中表达所得；本专利技术的实验步骤具体如下：1、将氨肽酶突变体的编码基因A-2进行酶切，连接至表达载体pPIC9，得到重组载体；2、将重组载体转化入毕赤酵母JC308中，得到新型氨肽酶的生产菌株JC308/pPIC9-A-2；3、以JC308/pPIC9-A-2为生产菌株发酵生产氨肽酶；所述氨肽酶突变体的酶学性质如下：(1)pH:pH6.0-9.0酶活稳定，最适作用pH8.0。(2)温度：60℃-80℃酶活稳定，最适作用温度为75℃。(3)耐热性：该酶在80℃保温1h酶活仍残留85％以上，90℃保温1h酶活仍存留45％以上。有益效果：1、本专利技术公布了一种全新的氨肽酶突变体，该突变体具有酶活高，热稳定性好的特点。该突变体摇瓶发酵液酶活可达2200U/mL，较原始氨肽酶提高57.14％；2、本专利技术获得的氨肽酶在80℃保温1h酶活仍残留85％以上，90℃保温1h酶活仍存留45％以上。附图说明：图1菌落PCR鉴定电泳图；其中，M为Marker；1为菌落PCR产物；图2氨肽酶最适pH曲线；图3氨肽酶最适温度曲线；图4氨肽酶温度稳定性曲线。具体实施方式：通过具体实施例对本专利技术作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本专利技术实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本专利技术原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本专利技术保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。实施例1氨肽酶基因A-2的获得本公司保藏的一株能产氨肽酶的枯草芽孢杆菌LD02，经紫外诱变筛选得到一株具有耐热氨肽酶活性的菌株CA23，根据其突变基因A-2的核苷酸序列设计PCR引物，5'端加入酶切位点XhoI，3'端加入酶切位点NotI，通过PCR得到突变基因A-2，其核苷酸序列为SEQIDNo.3。引物序列如下：A-2-F5'-CCGCTCGAGATGAAGGTACCAAAAACAAT-3'(SEQIDNo.5)A-2-R5'-TTGCGGCCGCCTAGCCGTCAGAGCGGTCTT-3'(SEQIDNo.6)此外，上述基因也可通过全序列合成的方法获得。实施例2重组载体pPIC9-A-2的构建分别对基因A-2和质粒pPIC9进行XhoI和NotI酶切，回收产物，将回收后的A-2和pPIC9按比例混合，用T4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布在LB(含氨苄霉素)固体平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落至LB液体培养基，37℃培养，菌液进行菌落PCR，电泳鉴定结果如图1，测序结果显示序列正确(SEQIDNo.3)，序列大小1.5kb。抽提重组质粒pPIC9-A-2待用。实施例3重组质粒转化毕赤酵母1.毕赤酵母JC308感受态细胞的制备1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5mL的YPD培养基，30℃，220r/min振荡过夜；2)取0.5mL的过夜培养的菌液，接种于50mL新鲜配制的YPD培养基，30℃，220r/min振荡培养，使OD600值达到1.3-1.5；3)取上述培养液于4℃，3000r/min，离心5min；4)弃去上清液，加入50mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；5)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入25mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；6)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入10mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；7)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入1mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀。8)分装100μL/管至无菌EP罐，-70℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。2.线性化质粒的转化抽提得到的重组质粒pPIC9-A-2用SalI进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻。1)将100μL感受态细胞移出至一新的无菌EP管中，加入10μL线性化质粒，轻吹混匀，吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；2)转化杯置于冰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氨肽酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种氨肽酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.4所示。2.如权利要求1所述的一种氨肽酶突变体，其特征在于，所述突变体的编码基因为A-2，基因A-2的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示。3.包含权利要求1或2所述氨肽酶或其编码基因的质粒或工程菌。4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文龙，王兴吉，郭庆文，曹世源，王克芬，钱娟娟，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37