一种α-淀粉酶基因及其应用制造技术

技术编号:20089057 阅读:23 留言:0更新日期:2019-01-15 08:11
本发明专利技术公开了一种α‑淀粉酶基因,所述淀粉酶基因从芽孢杆菌Bacillus sp.48‑1中分离得到,含有其构建的重组载体,基因工程菌及其产生的重组淀粉酶制剂。其具有内切α‑l,4糖苷键活性的淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,其基因的编码序列是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。通过构建重组载体并在大肠杆菌中表达,表达产物具有内切α‑l,4糖苷键功能,本发明专利技术描述的是淀粉酶在促进烟叶醇化等方面有重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种α-淀粉酶基因及其应用
本专利技术涉及一种淀粉酶,尤其是一种α-淀粉酶,编码该酶的基因,含有其编码基因的重组载体及其构建方法,基因工程菌及其应用,属于生物
和酶工程领域。
技术介绍
淀粉是葡萄糖分子聚合而成的,可分为直链淀粉和支链淀粉两种,通式为(C6H10O5)n。直链淀粉是无分支的螺旋结构,支链淀粉以24~30个葡萄糖残基以α-1,4-糖苷键首尾相连而成,在支链处为α-1,6-糖苷键。淀粉是植物体中贮存的养分,贮存在种子和块茎中,各类植物中的淀粉含量都较高。淀粉除食用外,还可作为制糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精的原料,也可用于调制印花浆、纺织品的上浆、纸张的上胶、药物片剂的压制等,同时,烟叶中的淀粉含量也对烟叶的品质产生很大的影响。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称,根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。α-淀粉酶存在于植物、动物、微生物,是淀粉水解的起始酶,微生物的淀粉酶一般是分泌性的;α-淀粉酶既作用于直链淀粉,亦作用于支链淀粉,无差别地随机切断糖链内部的α-1,4-链,最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主,此外,还有少量麦芽三糖及麦芽糖;在分解支链淀粉时,除麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖外,还生成α-糊精;β-淀粉酶主要见于高等植物中,在细菌、牛乳、霉菌中也有发现,和α-淀粉酶一样,也作用于α-1,4糖苷键,但它的作用是从非还原性末端开始,所以它对支链淀粉的水解是不完全的,当作用至α-l,4糖苷键时生成极限糊精,需要极限胡精酶的进一步作用。极限糊精酶对α-l,6糖苷键起专一性作用,但它不能直接降解淀粉粒,只有当α-淀粉酶作用后才起作用。目前,将α-淀粉酶用于促进烟草醇化的报道较少,虽然也有报道表明从芽孢杆菌中克隆得到淀粉酶基因,但是,基于菌株的选择、表达质粒的选用、构建质粒的方法等原因,获得的α-淀粉酶纯度不足,酶活性不佳,且不稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足,本专利技术提供一种α-淀粉酶及其编码该酶的基因,含有其编码基因的重组载体及其构建方法、基因工程菌及其应用。本专利技术采用的技术方案如下:本专利技术旨在提供一种从芽孢杆菌Bacillussp.48-1(菌种保藏号为:CGMCCNo.5311)中分离得到的淀粉酶基因,该基因核苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQIDNO.2所示,或与SEQIDNO.2互补的核苷酸序列,该基因序列长度为1977bp(碱基,包括终止密码子)。本专利技术的核苷酸序列是DNA形式的,包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA,可以是单链的或是双链的。由于核苷酸序列的特殊性,任何与SEQIDNO.2所示的核苷酸序列具有80%以上同源性且具有相同功能的多核苷酸变体,均在本专利技术的保护范围之内。所述多核苷酸变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列,可以使用本领域所熟知的取代、缺失或插入变异来获得。本专利技术中的淀粉酶基因编码的氨基酸序列是具有SEQIDNO.1所示的氨基酸残基序列的多肽或蛋白质。由于氨基酸序列的特殊性,只要是含有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的多肽片段或其变体,如其保守性变体、生物活性片段或衍生物与SEQIDNO.1所示的氨基酸残基序列具有90%以上同源性且具有相同活性的蛋白质,均在本专利技术的保护范围之内。这些方法包括氨基酸序列中氨基酸残基的缺失、插入、化学修饰或替换,所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白。本专利技术的另一目的是提供一种含有淀粉酶基因的重组表达载体,是将SEQIDNO.2所示基因直接与不同表达载体连接所构建的重组载体。本专利技术中,编码淀粉酶的多核苷酸序列可以插入到载体中,以构成含有本专利技术所述的重组载体。载体是指本领域所熟知的质粒、病毒或其他载体,本专利技术选用pET28a。可用本领域技术人员熟知的方法来构建含编码淀粉酶的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述编码淀粉酶的核苷酸序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体的PL启动子;真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子,通常大约有10-300bp,作用于启动子以增强基因的转录,如腺病毒增强子。本专利技术选用NdeI和BamHI作为SEQIDNO.2所示基因两端的酶切位点,诱导表达α-淀粉酶时,α-淀粉酶两端会连有组氨酸(His)标签,更加利于目的蛋白纯化。本专利技术中,编码淀粉酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可以用本领域的技术人员熟知的方法转化或者导入到宿主细胞中,该细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞,或这些宿主细胞的后代,代表性例子有:大肠杆菌;真菌细胞或酵母;植物细胞如油菜、烟草、大豆;昆虫细胞如果蝇S2或Sf9;动物细胞如CHO、COS或Bowes黑色素瘤细胞等。本专利技术还涉及所述编码基因在重组基因工程菌表达重组α-淀粉酶中的应用,通过常规的重组DNA技术,利用本专利技术的多核苷酸序列可以构建表达或生产重组的淀粉酶。一般来说可以通过以下步骤实现:构建重组载体,转化入宿主细胞构建重组细胞,在合适的培养基中培养宿主细胞,从培养基或细胞中分析、纯化蛋白质。本专利技术与现有技术相比,其有益效果为:(1)本专利技术描述的淀粉酶基因是从烟叶内分离的芽孢杆菌中克隆得来的,可以直接作用于烟叶醇化过程而无需担心生物因素对烟叶品质产生影响。(2)本专利技术选用了pET28a作为表达质粒,质粒背景清晰,可以利用乳糖操纵子来诱导表达,方便控制淀粉酶的表达量和表达时间,并且在构建质粒时,选用NdeI和BamHI作为SEQIDNO.2所示基因两端的酶切位点,诱导表达α-淀粉酶时,α-淀粉酶两端会连有组氨酸(His)标签,相对于现有技术于只在淀粉酶的C-末端加入了组氨酸(His)标签更容易与镍柱特异性结合,便于纯化。(3)本专利技术采用大肠杆菌表达系统,可以用来快速、大量表达淀粉酶,通过重组技术生产的重组淀粉酶仅经过两次简单的纯化步骤即可得到纯度超过95%的α-淀粉酶,其发酵液单位比酶活可以超过103IU超过原始菌株发酵产物酶活近100倍,而且酶活稳定,在pH5.0至pH8.0,反应温度30-45℃均保持有80%的活性,并且酶活高于现有的重组工程菌表达的α-淀粉酶的酶活。(4)本专利技术所需培养基及培养条件简单,工艺简单,周期短,大大降低了生产成本。该淀粉酶基因来源于烤烟表面微生物基因组,不仅可以作用于烤烟醇化过程,进而改变烤烟纯化进程,有利于改善烟叶品质,同时具有更好的安全性。附图说明图1为本专利技术构建的大肠杆菌BL21(DE3)表达载体Amy48-pET-28a;图2为本专利技术中重组质粒目的片段的菌落PCR验证图,图中M为大小2000bp的Maker;泳道1、2、3、4、5、为目的片段扩增产物。图3为本专利技术中重组质粒的单、双酶切图谱,图中:M为mak本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种α‑淀粉酶,其特征在于,所述淀粉酶基因从芽孢杆菌Bacillus sp. 48‑1中分离得到,淀粉酶由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
1.一种α-淀粉酶,其特征在于,所述淀粉酶基因从芽孢杆菌Bacillussp.48-1中分离得到,淀粉酶由SEQIDNO.1所示氨基酸序列组成。2.编码权利要求1所述α-淀粉酶淀粉酶的基因。3.根据权利要求2所述的基因,其特征在于,所述基因的编码序列是SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所示的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员:吴丽君白晓莉王毅朱杰杨德中段如敏孙万万魏云林季秀玲
申请(专利权)人:云南中烟工业有限责任公司
类型:发明
国别省市:云南,53

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