一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明专利技术提供的β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶PbNag39的酶学性质优异，对几丁二糖的比酶活为28.3U/mg，水解几丁寡糖的终产物均为N‑乙酰氨基葡萄糖。将该β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶与几丁质酶协同水解几丁质粉末，可高效制备得到N‑乙酰氨基葡萄糖。本发明专利技术的β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶具有比酶活高、热稳定性好和水解特性优异的特点，能在较广泛的pH范围内稳定并发挥催化作用，在几丁质转化中具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。
技术介绍
几丁质是β-N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖，广泛存在于自然界中，其含量仅次于纤维素。几丁质广泛存在于甲壳纲动物虾蟹的甲壳、昆虫的外壳以及植物和真菌的细胞壁中(LvY.M.,LabordaP.,HuangK.,etal.Highlyefficientandselectivebiocatalyticproductionofglucosaminefromchitin.GreenChemistry,2017,19:527-535)。几丁质降解酶系按酶切位置和作用方式不同可分为内切几丁质酶(endochitinase，EC3.2.1.14)、外切几丁质酶(exochitinase，EC3.2.1.14)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase，EC3.2.1.52)。内切几丁质酶能随机水解几丁质主链中β-1,4-糖苷键，产生低分子量的几丁寡糖，而β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶则从几丁寡糖的非还原端逐个切下N-乙酰氨基葡萄糖。根据氨基酸序列的同源性，现有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶分属于糖苷水解酶3、20、84和116家族。迄今，绝大多数β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶3、20和84家族，少数属于糖苷水解酶116家族，糖苷水解酶18家族的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶尚未见报道。N-乙酰氨基葡萄糖长期以来广泛应用于食品、医药和化妆品等行业(ChenJ.K.,ShenC.R.andLiuC.L.N-Acetylglucosamine:ProductionandApplications.MarineDrugs,2010,8:2493-2516)。传统上，N-乙酰氨基葡萄糖是通过酸水解几丁质产生，产生的大量酸性废弃物会导致严重的环境污染(PatilN.S.andJadhavJ.P.EnzymaticproductionofN-acetyl-D-glucosaminebysolidstatefermentationofchitinasebyPenicilliumochrochloronMTCC517usingagriculturalresidues.InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2014,91:9-17)。因此，N-乙酰氨基葡萄糖的绿色生物生产具有重要的意义和应用价值。近年来，酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖因其高效无污染而被广泛关注。如专利号2015107793579利用几丁质酶与几丁质的亲和吸附可高效生产N-乙酰氨基葡萄糖。Suresh等(SureshP.V.andKumarP.K.A.Enhanceddegradationofa-chitinmaterialspreparedfromshrimpprocessingbyproductandproductionofN-acetyl-D-glucosaminebythermoactivechitinasesfromsoilmesophilicfungi.Biodegradation,2012,23:597-607)利用几丁质酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解几丁质粉末生产N-乙酰氨基葡萄糖，得率为23.7％。为了高效的完全转化几丁质为N-乙酰氨基葡萄糖，几丁质往往需要预处理。传统的预处理方法主要包括机械方法(球磨)、化学方法(酸碱等)和生物方法，其中球磨是一种能够显著降低几丁质结晶度从而提高其转化率的预处理方法。近年来一些新型的预处理方法如天然低共熔溶剂(NADESs)由于其具有化学性质稳定、不可燃性、低蒸气压、低毒性和较高的可降解性等优点而被广泛研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种巴伦葛兹类芽孢杆菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本专利技术提供了一种蛋白质，获自巴伦葛兹类芽孢杆菌，命名为PbNag39，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。本专利技术还保护编码PbNag39的基因。将所述基因命名为PbNag39基因。所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；(b2)序列表中序列2所示的DNA分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的DNA分子；(b4)来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌且与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。本专利技术还保护含有PbNag39基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2自5’端第1-1038位替代SUMO-pET28a载体的EcoRI和NotI酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。本专利技术还保护所述PbNag39的应用，为如下(c1)-(c5)中至少一种：(c1)作为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶；(c2)制备N-乙酰氨基葡萄糖；(c3)水解几丁二糖；(c4)水解几丁寡糖；(c5)以几丁质为原料制备N-乙酰氨基葡萄糖。本专利技术还保护一种重组菌，是将PbNag39基因导入宿主菌中得到的。所述PbNag39基因可通过含有PbNag39基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列2自5’端第1-1038位替代SUMO-pET28a载体的EcoRI和NotI酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21。本专利技术还保护一种β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，从重组菌中得到β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。本专利技术还保护所述方法制备得到的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。本专利技术还保护制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法，为方法A或方法B或方法C。所述方法A包括如下步骤：采用PbNag39水解几丁二糖，制备β-N-乙酰氨基葡萄糖。所述水解的液体环境为50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)。所述水解的温度为60℃。所述PbNag39在水解体系中的浓度为1U/mL。所述方法B包括如下步骤：采用PbNag39水解几丁寡糖，制备β-N-乙酰氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列1衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；(b2)序列表中序列2所示的DNA分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的DNA分子；(b4)来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌且与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)-(c5)中至少一种：(c1)作为β-N-乙酰氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，刘翊昊，闫巧娟，马帅，杨绍青，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11