一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法。本发明专利技术首次通过对半纤维素酶表达基因和酿酒酵母菌株的筛选，成功获得了能够在孢子二酪氨酸层与壳聚糖层之间固定的半纤维素酶，通过对该固定化的半纤维素酶进行检测，发现固定化酶的最适温度提高到75℃、最佳反应pH值降低为3.2，在磷酸盐浓度20mmol/L、Mg

【技术实现步骤摘要】
一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法
本专利技术涉及一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法，属于酶固定化

技术介绍
固定化酶(Immobilizationofenzymes)，一般情况下指的是把酶和某些材料通过一定的方法、原理组装在一起，从而达到能够把酶固定在限制的区间里面的目的，最终的结果是让酶在既能够进行正常的催化反应、又能够实现酶的回收利用的新型技术。因此经过固定后的酶，不仅保留了基本特性，高效性、专一性，而且还具有了更多的优势。酶虽然比化学催化剂更加高效、专一，但是因为酶大部分都是蛋白质，而蛋白质在环境中是非常不稳定的，因此，游离酶也很不稳定，保存不当很容易失活，而且游离酶也很难回收重复使用，但是，固定化酶却刚好弥补了游离酶的不足，经过固定后的酶，稳定性提高、更加容易分离，而且固定后的酶还可以抵抗一些不良因素的刺激。广义上主要有两种固定化酶的形式：化学法和物理法，狭义上根据它们的作用方式以及构成的差别，可以把它们分为以下四种方法：吸附法、载体结合法、交联法和包埋法。吸附法就是把一些酶或者是包含酶的一些菌体通过吸附剂的吸附作用，与吸附剂结合，从而把酶成功的固定在吸附剂上；载体结合法通常是把酶蛋白的非催化基团通过化学键的作用与载体结合，主要是共价键，而且这种结合是不可逆转的；交联法是把酶与酶之间形成网状结构，主要是通过一些带有双功能团的试剂作为桥架，间接的使酶与酶发生交联，常用的带有双功能团的试剂为戊二醛；包埋法是把酶包裹在凝胶形成的网状小区间中或者包裹在某些聚合物的膜内，这些膜可以允许一些物质通过，从而形成小格型固定化酶和微小胶囊型固定化酶两种。半纤维素酶是指能降解半纤维素生成木糖和甘露糖等物质的一组酶的总称，主要由细菌和霉菌发酵产生。半纤维素是自然界中仅次于纤维素的可再生有机资源，与纤维素(β—1,4葡聚糖主链)相比，其结构与组成十分复杂，包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖和木聚葡萄糖等多种组份。产半纤维素酶的微生物分布很广，有几十个属、一百多个种，包括细菌、放线菌、真菌以及某些酵母。目前研究的较清楚的有芽孢杆菌、链霉菌、曲霉、镰刀菌、裂褶菌、木霉及多孔菌等。中国专利文献CN104380866A(申请号201410596638.6)公开了一种酶法改良盐碱土壤的方法，本专利技术利用纤维素酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、蛋白酶、半纤维素酶组成复合酶，利用硅藻土、膨润土为固定化载体，制成固定化复合酶；将固定化复合酶均匀施撒在有粉碎秸秆的地上，结合深耕，灌溉。通过添加固定化复合酶对植物秸秆进行充分和加速分解，从而提高土壤中的活性有机质含量，最终达到提高土壤肥力和土壤质量的目的。上述固定化方式虽然适合复合酶，但并不适合半纤维素酶单一酶进行固定化。酿酒酵母的孢子形成过程主要经历三个主要的阶段，前期、中期和后期。前期，在缺乏氮源、缺少葡萄糖以及遗传配对等多种因素的作用下，均会诱导酿酒酵母细胞进入产孢阶段，终止于有丝分裂G1期，进入减数分裂前期S期，前期包括DNA复制、同源重组配对。DNA复制后，进行同源重组、染色体配对，产孢前期需要完成细胞周期机制的转变以及RNA过程的转变。中期主要就是减数分裂期，细胞减数分裂后，会产生四个单倍体细胞核，这些细胞核然后经过一系列的包装过程，从而形成子细胞。母细胞质膜开始变化，最开始会形成四个SPB(纺锤体)，通过调控，新合成的膜在SPB处形成，称之为前孢子膜。前孢子膜的形成也需要后期分泌途径的改变，因此高尔基体小泡需要从质膜转运到前孢子膜，使前孢子膜继续合成并且延伸。在这个时期，同时线粒体和其他的细胞器会进入前孢子膜与核膜形成的胞质空间内，然后进行核分裂产生子细胞核，每一个前孢子膜分别包裹唯一的子细胞核，前孢子膜闭合。后期，在前孢子膜闭合后，孢子壁开始在双层前孢子膜中间组装，孢子壁的分层组装是包子成熟的必经阶段。除此之外，染色体的折叠以及细胞器等的合成也是在前孢子膜膜闭合之后进行。孢子壁组装完成后母细胞会围绕孢子形成的成熟生长的子囊孢子。中国专利文献CN103436520A(申请号201310422568.8)公开了一种以酿酒酵母孢子为载体的新型固定化酶的制备方法及固定化酶，其通过使用一种酿酒酵母缺陷型菌株△dit1，此菌株产生的孢子壁不含最外层的二酪氨酸层，暴露在最外面的一层是壳聚糖，将酶直接固定在此缺陷型的孢子上，得到固定化酶。该专利技术直接通过培养酿酒酵母△dit1菌株获得大量的酿酒酵母的子囊孢子，再加以破壁纯化得到目的产品，就可以做相应的应用，而无需获得像一般固定化酶所需的载体，方法简便，易于操作，节省费用。虽然该缺陷型酵母在生成子囊孢子的过程中可以在表面展示需要固定的酶，但在实际展示半纤维素酶的过程中，使用效果并不理想，主要是在实际使用过程中，孢子容易破壁萌发，导致酶活急剧下降；目前并没有较好的解决方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法，是通过重组质粒转化构建表达目的酶的重组酿酒酵母，在特定条件下培养重组酿酒酵母使其进行孢子繁殖，目的酶表达定位在重组酿酒酵母孢子壁的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的间隙，收集纯化孢子并进行固定化，得到固定化的重组孢子酶颗粒。所述表达定位通过信号肽引导半纤维素酶表达在孢子壁间隙。为解决上述技术问题，本专利技术技术方案如下：一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法，包括如下步骤：(1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，分别经PCR扩增，获得半纤维素酶表达基因xynA基因和信号肽Epr基因；所述PCR扩增的上、下游引物核苷酸序列如下：xynA基因扩增引物上游引物：5'-CAGGATCCTTCTCAAGGAACGATCAG-3'(下划线为BamHI酶切识别位点)下游引物：5'-TTGAGCTCACGAGTGCTACCTCAAAG-3'(下划线为SacI酶切识别位点)Epr基因扩增引物上游引物：5'-CGGAATTCATGAAAAACATGTCTTG-3'(下划线为EcoRI酶切识别位点)下游引物：5'-TTGGATCCATAACCTCTTTCTCGC-3'(下划线为为BamHI酶切识别位点)；(2)将步骤(1)得到的半纤维素酶表达基因xynA和信号肽基因Epr分别插入到氨苄抗性质粒pRS424中，经鉴定，制得重组质粒pRS424-xynA-Epr；(3)将步骤(2)制得的重组质粒pRS424-xynA-Epr转化酿酒酵母OSW2Δ缺陷型菌株，经含氨苄的SD-Trp缺陷性平板筛选，制得重组酿酒酵母；(4)将重组酿酒酵母接种至SD-Trp培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h；然后转接至YPAce培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h，制得菌液；(5)离心步骤(4)的菌液收集细胞，清洗，转接至质量百分比浓度1.5％～3％醋酸钾溶液中，28℃～32℃振荡培养24h～48h，使酿酒酵母细胞繁殖子囊孢子，制得孢子菌液；(6)离心步骤(5)的孢子菌液，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2～3次，然后用PBS缓冲液重悬细胞；向细胞悬浮液中加入Lyticase溶壁酶处理1～1.5h后，冰浴超声波破碎；用PBS溶液洗涤破碎细胞2～3次，弃去上清液，分离纯化，制得游离状态的重组酿酒酵母孢子；(7)将步骤(6)制得的游本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，分别经PCR扩增，获得木聚糖酶xynA基因和信号肽Epr基因；所述PCR扩增的上、下游引物核苷酸序列如下：xynA基因扩增引物上游引物：5'‑CAGGATCCTTCTCAAGGAACGATCAG‑3'；下游引物：5'‑TTGAGCTCACGAGTGCTACCTCAAAG‑3'；Epr基因扩增引物上游引物：5'‑CGGAATTCATGAAAAACATGTCTTG‑3'；下游引物：5'‑TTGGATCCATAACCTCTTTCTCGC‑3'；(2)将步骤(1)得到的半纤维素酶表达基因xynA和信号肽基因Epr分别插入到氨苄抗性质粒pRS424中，经鉴定，制得重组质粒pRS424‑xynA‑Epr；(3)将步骤(2)制得的重组质粒pRS424‑xynA‑Epr转化酿酒酵母OSW2Δ缺陷型菌株，经含氨苄的SD‑Trp缺陷性平板筛选，制得重组酿酒酵母；(4)将重组酿酒酵母接种至SD‑Trp培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h；然后转接至YPAce培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h，制得菌液；(5)离心步骤(4)的菌液收集细胞，清洗，转接至质量百分比浓度1.5％～3％醋酸钾溶液中，28℃～32℃振荡培养24h～48h，使酿酒酵母细胞繁殖子囊孢子，制得孢子菌液；(6)离心步骤(5)的孢子菌液，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2～3次，然后用PBS缓冲液重悬细胞；向细胞悬浮液中加入Lyticase溶壁酶处理1～1.5h后，冰浴超声波破碎；用PBS溶液洗涤破碎细胞2～3次，弃去上清液，分离纯化，制得游离状态的重组酿酒酵母孢子；(7)将步骤(6)制得的游离状态的重组酿酒酵母孢子采用海藻酸钠包埋固定法固定，制得固定化酶颗粒。...

【技术特征摘要】
1.一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，分别经PCR扩增，获得木聚糖酶xynA基因和信号肽Epr基因；所述PCR扩增的上、下游引物核苷酸序列如下：xynA基因扩增引物上游引物：5'-CAGGATCCTTCTCAAGGAACGATCAG-3'；下游引物：5'-TTGAGCTCACGAGTGCTACCTCAAAG-3'；Epr基因扩增引物上游引物：5'-CGGAATTCATGAAAAACATGTCTTG-3'；下游引物：5'-TTGGATCCATAACCTCTTTCTCGC-3'；(2)将步骤(1)得到的半纤维素酶表达基因xynA和信号肽基因Epr分别插入到氨苄抗性质粒pRS424中，经鉴定，制得重组质粒pRS424-xynA-Epr；(3)将步骤(2)制得的重组质粒pRS424-xynA-Epr转化酿酒酵母OSW2Δ缺陷型菌株，经含氨苄的SD-Trp缺陷性平板筛选，制得重组酿酒酵母；(4)将重组酿酒酵母接种至SD-Trp培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h；然后转接至YPAce培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h，制得菌液；(5)离心步骤(4)的菌液收集细胞，清洗，转接至质量百分比浓度1.5％～3％醋酸钾溶液中，28℃～32℃振荡培养24h～48h，使酿酒酵母细胞繁殖子囊孢子，制得孢子菌液；(6)离心步骤(5)的孢子菌液，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2～3次，然后用PBS缓冲液重悬细胞；向细胞悬浮液中加入Lyticase溶壁酶处理1～1.5h后，冰浴超声波破碎；用PBS溶液洗涤破碎细胞2～3次，弃去上清液，分离纯化，制得游离状态的重组酿酒酵母孢子；(7)将步骤(6)制得的游离状态的重组酿酒酵母孢子采用海藻酸钠包埋固定法固定，制得固定化酶颗粒。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，木聚糖酶xynA基因和信号肽Epr基因的PCR扩增体系均如下所示，总体积50μL：3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，xynA基因的PCR扩增程序如下：95℃预变性10min；94℃变性35sec，57℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；优选的，所述步骤(1)中，Epr基因的PCR扩增程序如下：95℃预变性10min；94℃变性35sec，63℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，鉴定的具体步骤如下：将重组后的质粒转入大肠杆菌DH5α，用含氨苄浓度60ug/mL的LB液体培养基过夜培养，提取质粒，用内切酶BamHI和SacI、EcoRI和BamHI分别进行酶切鉴定，检测酶切片段大小。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，转化采用醋酸锂/PEG的方法，具体步骤如下：a)挑取OSW2Δ缺陷型酿酒酵母单菌落接种于20mLYEPD液体培养基，30℃，200rpm，过夜培养，测定菌液的OD600值；将菌液接种于50mLYEPD液体培养基至细胞浓度为(2～8)×106细胞/mL，30℃，200rpm，振荡培养4～6h；然后室温5000rpm离心5min，弃去培养液，收集菌体；b)用30mL无菌水重悬菌体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘可春，何秋霞，李宁，楚杰，韩利文，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37