本发明专利技术涉及一种利用大肠杆菌生产胞外阿魏酸酯酶的方法。该方法包括如下步骤：(1)制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述的阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经IPTG或乳糖诱导发酵，经去除菌体，纯化，制得阿魏酸酯酶。本发明专利技术首次通过采用限制性内切酶Nde I酶切阿魏酸酯酶基因后，核糖体结合位点后的首个酶切位点变为Nde I酶切位点，从而获得的阿魏酸酯酶具有天然的N端序列；该特殊结构使得阿魏酸酯酶能够在大肠杆菌合成后分泌至胞外，从而极大简化了阿魏酸酯酶的纯化和利用，对后续阿魏酸的工业化生产具有显著的促进作用。
【技术实现步骤摘要】
一种利用大肠杆菌生产胞外阿魏酸酯酶的方法
本专利技术涉及一种利用大肠杆菌生产胞外阿魏酸酯酶的方法，属于生物技术
技术介绍
阿魏酸酯酶最早应用于木质纤维素的降解。随着社会的发展和能源危机，越来越多的研究关注于利用木质纤维素来生产生物乙醇，其技术关键是将木质纤维素转化为可发酵的碳源。由于植物细胞壁交联的网状结构，其降解需要一系列纤维素酶和半纤维素酶的协同作用。阿魏酸酯酶属于半纤维素酶家族，它能够打开半纤维素之间、半纤维素和木质素之间交联的酯键，从而有助于其它酶与木质纤维素的结合。根据底物特异性和序列相似性，阿魏酸酯酶可以分为A、B、C、D四个类型。在阿魏酸酯酶作用木质纤维素的过程中，还能够获得高附加值产物阿魏酸。阿魏酸广泛存在于谷物、水果、蔬菜等植物性食品中，通过酯键与植物细胞壁中的其它成分相交联，根据来源不同最多能占细胞干重的3％。通过阿魏酸酯酶释放的阿魏酸可以应用于保健品和化妆品中。阿魏酸发挥生理作用的方式依赖其抗氧化功能：分子苯环上的3-甲氧基、4-羟基和羧基基团，能够高效的清除活性氧；上调作用细胞中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶等的活性。因此，阿魏酸成为治疗多种与氧化压力相关疾病的潜在物质，例如阿尔茨海默病、癌症、心血管疾病、糖尿病和皮肤病等。乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是指一类能够发酵可溶性碳水化合物，产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称。它包括多个属的物种，乳杆菌属(Lactobacillus)是其重要组成部分。乳杆菌分布广泛，天然存在于人体肠道、乳制品、发酵植物食品中。随着相关研究的增多，乳杆菌的应用价值已受到广泛的认可。在医药健康领域中，具有维持微生态平衡、降低胆固醇、提高免疫力等功能；在食品行业中，能够赋予产品独特的风味和更长的保质期。近些年来，关于乳杆菌所产的阿魏酸酯酶逐渐受到研究重视。鉴于乳杆菌作为公认的GRAS菌株以及阿魏酸酯酶在食品、医药和化妆品行业的应用潜力，自从首例报道之后就颇受关注。目前已从肠道或发酵植物产品中鉴定出多种产阿魏酸酯酶的乳杆菌，包括噬淀粉乳杆菌、植物乳杆菌、约氏乳杆菌、瑞士乳杆菌等。大肠杆菌因其清楚的基因背景和完善的蛋白表达调控工具，已被作为细胞工厂来生产多种微生物来源的阿魏酸酯酶。但是由于大肠杆菌具有内外双层膜结构，使得阿魏酸酯酶的分泌表达成为一个难题。大肠杆菌所表达的阿魏酸酯酶通常位于胞内，获得纯化的酶常常需要复杂的纯化过程。因此，目前阿魏酸酯酶标准品价格昂贵，其生产工艺达不到工业化规模水平，因此无法实际应用于各相关领域。中国专利文献CN108342371A(申请号201810324103.1)公开了一种来源于土壤的新型阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。将该酯酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，纯化后的重组酶(FAE-Xuan)分子量大小为29kDa。FAE-Xuan对底物阿魏酸甲酯的催化活性最高，酶活为40U/mg，其最适温度为30℃，最适pH为5.0。在pH3.0-10.0下反应4h后，该酶仍能保持75％以上的活性，显示出较强的pH稳定性。中国专利文献CN102719414A(申请号201210132351.9)一种新型阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；本专利技术还公开了所述新型阿魏酸酯酶的DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还公开了含有上述新型阿魏酸酯酶DNA的表达载体、重组阿魏酸酯酶及其制备方法，以及所述重组阿魏酸酯酶在降解植物细胞壁中的应用。上述文献中所表达的阿魏酸酯酶均为胞内表达，依然无法避免后续复杂的纯化过程。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种利用大肠杆菌生产胞外阿魏酸酯酶的方法。本专利技术技术方案如下：一种利用大肠杆菌生产胞外阿魏酸酯酶的方法，包括如下步骤：(1)制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述的阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经IPTG或乳糖诱导发酵，经固液分离去除菌体，纯化，制得阿魏酸酯酶。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤如下：(i)以噬淀粉乳杆菌CGMCC11056的全基因组序列为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因；PCR扩增特异引物核苷酸序列如下：Forward：5`-TATACATATGTCCCGCATTACAATTG-3`Reverse：5`-TATGCTCGAGGAATAATGGTTTTAAAAAT-3`(ii)用内切酶NdeI和内切酶XhoI双酶切步骤(1)制得的PCR产物，插入载体pET22b中，转化大肠杆菌，制得重组大肠杆菌。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(i)中，PCR扩增条件：PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸5min，16℃保存。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(ii)中，大肠杆菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，诱导发酵步骤如下：将重组大肠杆菌接种于LB培养基中，35～38℃培养至OD600为0.5～0.8，然后加入IPTG至培养基中浓度为0.4～0.8mM，继续诱导发酵16～24小时；或者，将重组大肠杆菌接种于含有乳糖的培养基中，35～38℃发酵36～48小时。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，固液分离为4℃、13000rpm条件下离心15min。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，纯化步骤如下：将固液分离后的液体经孔径0.22μm滤膜过滤，制得滤液，然后经Histrap柱分离，PBS缓冲液中4℃下过夜透析，即得。根据本专利技术进一步优选的，所述的Histrap柱分离步骤如下：用5倍柱体积的超纯水过Histrap柱，速度为1mL/min，然后用5倍柱体积的BingingBuffer过柱子，再将滤液过Histrap柱吸附，然后用10倍柱体积的BindingBuffer进行洗脱，再用5倍柱体积的ElutionBuffer过柱子，收集洗脱液，即得；上述BingingBuffer组份如下：20mM磷酸盐，500mM氯化钠，25mM咪唑，调节pH为7.4；WashingBuffer组份如下：20mM磷酸盐，500mM氯化钠，50mM咪唑，调节pH为7.4；ElutionBuffer组份如下：20mM磷酸盐，500mM氯化钠，500mM咪唑，调节pH为7.4。一种生产阿魏酸的方法，包括如下步骤：(1)制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述的阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经发酵培养基培养并诱导阿魏酸酯酶表达，经去除菌体，纯化，制得阿魏酸。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤如下：(i)以噬淀粉乳杆菌CGMCC11056的全基因组序列为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因；PCR扩增特异引物核苷酸序列如下：Forward：5`-TATACATATGTCCCGCATTACAATTG-3`Reverse：5`-TATGCTCGAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用大肠杆菌生产胞外阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述的阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经IPTG或乳糖诱导发酵，经去除菌体，纯化，制得阿魏酸酯酶。
【技术特征摘要】
1.一种利用大肠杆菌生产胞外阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述的阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经IPTG或乳糖诱导发酵，经去除菌体，纯化，制得阿魏酸酯酶。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤如下：(i)以噬淀粉乳杆菌CGMCC11056的全基因组序列为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因；PCR扩增特异引物核苷酸序列如下：Forward：5`-TATACATATGTCCCGCATTACAATTG-3`Reverse：5`-TATGCTCGAGGAATAATGGTTTTAAAAAT-3`(ii)用内切酶NdeI和内切酶XhoI双酶切步骤(1)制得的PCR产物，插入载体pET22b中，转化大肠杆菌，制得重组大肠杆菌。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中，PCR扩增条件：PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸5min，16℃保存；进一步优选的，所述步骤(ii)中，大肠杆菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，诱导发酵步骤如下：将重组大肠杆菌接种于LB培养基中，35～38℃培养至OD600为0.5～0.8，然后加入IPTG至培养基中浓度为0.4～0.8mM，继续诱导发酵16～24小时；或者，将重组大肠杆菌接种于含有乳糖的培养基中，35～38℃发酵36～48小时；优选的，所述步骤(2)中，固液分离为4℃、13000rpm条件下离心15min；优选的，所述步骤(2)中，纯化步骤如下：将固液分离后的液体经孔径0.22μm滤膜过滤，制得滤液，然后经Histrap柱分离，PBS缓冲液中4℃下过夜透析，即得。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的Histrap柱分离步骤如下：用5倍柱体积的超纯水过Histrap柱，速...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐振上，王婷，刘新利，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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