一种具有催化活性转氨酶的提取方法技术

技术编号:20089041 阅读:28 留言:0更新日期:2019-01-15 08:10
本发明专利技术提出一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,通过对含有转氨酶的菌体细胞离心、洗涤和破碎后再加入硫酸铵溶液去掉破碎细胞体,得到上清溶液,再向上清溶液内加入硫酸铵进行静置沉淀和分离得到转氨酶粗品,最后向转氨酶粗品中加入混合溶液进行搅拌、离心和出去上清后得到成品转氨酶;本发明专利技术提出通过硫酸铵盐析沉淀分离出菌体细胞内的活性转氨酶,通过纯化水、聚乙二醇和二甲基亚砜配置出的混合溶液可以洗掉盐析转氨酶粗品中大部分的硫酸铵,同时该混合溶液不会溶解转氨酶,提取效率高,并能保持转氨酶的催化活性,过程中不会产生大量的废水,环保且成本低廉适用于大规模的生产。

【技术实现步骤摘要】
一种具有催化活性转氨酶的提取方法
本专利技术属于生物制药
,尤其涉及一种具有催化活性的转氨酶的提取方法。
技术介绍
转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶,普遍存在于动物、植物组织和微生物中,心肌、脑、肝、肾等动物组织以及绿豆芽中,它在生物催化反应中参与氨基酸的一系列分解和合成,它催化某一氨基酸的α-氨基酸转移到另一α-酮酸的酮基上,生成相应的氨基酸,同时具有一定的选择性,尤其是不对称合成上的应用,体现了它的高效、专一和稳定性,并且催化条件温和,更加节约成本。国家知识产权局于2014年5月13日公布的一篇专利申请号为201410198961.8,名称:一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法,此专利提出通过发酵得到的含酶菌体,经过陶瓷复合膜截留分子量为6000蛋白,控制温度4-10℃,然后通过溶剂沉淀、浓缩、真空干燥、加辅料保护酶活等方法得到较纯的转氨酶,该一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法存在以下问题:1.膜分离工艺在实际制备过程中设备投入较大,陶瓷膜需反复清洗活化,会产生大量废水,造成成本较高;2.使用溶剂沉淀以及浓缩过程中会使部分酶活性丧失,处理过程较长,实用性窄,不适合大批量制备。国家知识产权局于2009年11月23日公布的一篇专利申请号为200910154642.6,名称:一种谷氨酰胺转氨酶制备方法,此专利提出通过将发酵液破碎处理后离心得到上清含有转氨酶,再经过微滤膜除菌和除去杂质得到粗酶液,再经过超滤膜处理,截留一定分子量的蛋白,即得到转氨酶产物,该一种谷氨酰胺转氨酶制备方法存在以下问题:通过微滤和超滤来纯化转氨酶,制备成本较高,设备投入量大,同样不适用于大规模生产。酶对外部环境敏感,易失去催化活性,所以它的提取方法是关键,大多数酶制剂需要高纯度,因此一般使用超滤或层析,而对于催化用酶,要求相对纯度可以低一些,一般用盐析沉淀得到粗蛋白,之后需进行层析或透析脱盐,对于大规模生产显然有很大限制,尤其是对脱盐设备的投入大和产生的废水量较大,附加值较低的产品投入就不经济。因此,本专利技术提出一种具有催化活性的转氨酶的提取方法以解决现有技术的不足之处。
技术实现思路
针对上述问题,本专利技术提出硫酸铵盐析沉淀分离出菌体细胞内的活性转氨酶,通过纯化水、聚乙二醇和二甲基亚砜配置出的混合溶液可以洗掉盐析转氨酶粗品中大部分的硫酸铵,同时该混合溶液不会溶解转氨酶,提取效率高,并能保持转氨酶的催化活性,过程中不会产生大量的废水,环保且成本低廉适用于大规模的生产。一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,包括如下步骤:步骤一:通过发酵培养并诱导出含有转氨酶的菌体细胞,再经过离心、洗涤和破碎得到转氨酶混合液;步骤二:向上述步骤一中的转氨酶混合液中加入浓度为6%—30%的硫酸铵溶液,控制温度低于10℃,再离心去掉破碎细胞体,得到上清溶液;步骤三:向上述步骤二中的上清溶液中加入硫酸铵进行静置沉淀,沉淀后进行离心,得到转氨酶粗品;步骤四:向上述步骤三中的转氨酶粗品中加入混合溶液,进行搅拌,搅拌后进行离心,离心后再去除上清,得到成品转氨酶固体后进行真空冷冻干燥保存即可。进一步改进在于:所述步骤一中的菌体细胞为:一株产谷氨酰胺转氨酶转基因菌株以4%的接种量接入种子培养基,在8℃,210r/min条件下培养48h后得到的菌体细胞。进一步改进在于:所述步骤一、步骤二、步骤三和步骤四中的离心均为密度梯度离心法,所述步骤一、步骤二、步骤三和步骤四均在10℃温度下完成。进一步改进在于:所述步骤一中先将菌体细胞放入离心机内,控制离心机内的离心加速度为8000G,离心时间为5min,再进行去除上清,得到菌泥。进一步改进在于:所述步骤一中先将一株产谷氨酰胺转氨酶转基因菌株以4%的接种量接入种子培养基,在8℃,210r/min条件下培养24h后得到一种具有催化活性的转氨酶菌体细胞,再将菌体细胞放入离心机内,控制离心机内的离心加速度为8000G,离心时间为5min,再进行去除上清,得到菌泥,再向菌泥内加入2倍体积PH值为7.4的磷酸缓冲溶液进行搅拌洗涤1次,然后将洗涤后的菌泥导入离心机内进行离心,控制离心机内的离心加速度为8000G,然后再加入5倍量的去离子水进行搅拌均匀,得到悬浮液,最后将悬浮液使用1200psi的高压,在低于10℃的温度下破碎循环2次得到菌体破碎液。进一步改进在于:所述步骤二中先加入浓度为6%—30%的硫酸铵溶液,进行搅拌20-30min,控制温度低于10℃,再导入离心机内进行离心去掉破碎细胞体,控制离心机内的离心加速度为8000G,得到上清溶液。进一步改进在于:所述步骤三中先将上清溶液倒入容器中,缓慢加入硫酸铵固体,进行搅拌直至固体慢慢溶解,控制容器内硫酸铵的浓度为50%-70%,然后静置沉淀2小时,再将沉淀后的上清上清溶液导入离心机内进行离心,控制离心机内的离心加速度为12000G,然后去除上清,得到转氨酶粗品。进一步改进在于:所述步骤四中的混合溶液为纯化水、聚乙二醇和二甲基亚砜按照比例3:4:3-2:5:3进行混合,然后冷却至10℃以下,制成的混合溶液,所述混合溶液PH值为6-9。进一步改进在于:所述步骤四中先向转氨酶粗品中加入混合溶液,进行搅拌30min,保持温度低于5℃,再通过离心机进行离心,控制离心机内的离心加速度为12000G,离心后去除上清,得到转氨酶固体,再将转氨酶固体放入真空冷冻干燥机干燥处理,得到成品转氨酶,最后将成品转氨酶保存在-20℃环境下即可。进一步改进在于:所述混合溶液经过浓缩、析出和过滤后可重复使用。本专利技术的有益效果为:1.本专利技术通过硫酸铵盐析沉淀分离出菌体细胞内的活性转氨酶,通过纯化水、聚乙二醇和二甲基亚砜配置出的混合溶液可以洗掉盐析转氨酶粗品中大部分的硫酸铵,同时该混合溶液不会溶解转氨酶,提取效率高,并能保持转氨酶的催化活性,过程中不会产生大量的废水,环保且成本低廉适用于大规模的生产;2.本专利技术中的混合溶液经过浓缩、析出和过滤后可回收循环使用,方法实用性强,且环保经济;3.本专利技术转氨酶提取工艺过程中使用的设备较少,同时没有使用脱盐设备,大大降低了设备投入成本,适用于不同规模的生产,通用性高。附图说明图1为本专利技术实施例提取出的成品转氨酶定量催化HPLC检测结果图;图2为本专利技术实施例提取处的转氨酶与标准酶蛋白凝胶电泳对比图;图3为标准转氨酶蛋白定量催化HPLC检测结果图。具体实施方式为了使专利技术实现的技术手段、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本专利技术。实施例一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,包括如下步骤:步骤一:先将一株产谷氨酰胺转氨酶转基因菌株以4%的接种量接入种子培养基,在8℃,210r/min条件下培养24h后得到一种具有催化活性的转氨酶菌体细胞,再将菌体细胞放入离心机内,控制离心机内的离心加速度为8000G,离心时间为5min,再进行去除上清,得到菌泥,再向菌泥内加入2倍体积PH值为7.4的磷酸缓冲溶液进行搅拌洗涤1次,然后将洗涤后的菌泥导入离心机内进行离心,控制离心机内的离心加速度为8000G,然后再加入5倍量的去离子水进行搅拌均匀,得到悬浮液,最后将悬浮液使用1200psi的高压,在低于10℃的温度下破碎循环2次得到菌体破碎液;步骤二:先加入本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,其特征在于:包括如下步骤:步骤一:通过发酵培养并诱导出含有转氨酶的菌体细胞,再经过离心、洗涤和破碎得到转氨酶混合液;步骤二:向上述步骤一中的转氨酶混合液中加入浓度为6%—30%的硫酸铵溶液,控制温度低于10℃,再离心去掉破碎细胞体,得到上清溶液;步骤三:向上述步骤二中的上清溶液中加入硫酸铵进行静置沉淀,沉淀后进行离心,得到转氨酶粗品;步骤四:向上述步骤三中的转氨酶粗品中加入混合溶液,进行搅拌,搅拌后进行离心,离心后再去除上清,得到成品转氨酶固体后进行真空冷冻干燥保存即可。

【技术特征摘要】
1.一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,其特征在于:包括如下步骤:步骤一:通过发酵培养并诱导出含有转氨酶的菌体细胞,再经过离心、洗涤和破碎得到转氨酶混合液;步骤二:向上述步骤一中的转氨酶混合液中加入浓度为6%—30%的硫酸铵溶液,控制温度低于10℃,再离心去掉破碎细胞体,得到上清溶液;步骤三:向上述步骤二中的上清溶液中加入硫酸铵进行静置沉淀,沉淀后进行离心,得到转氨酶粗品;步骤四:向上述步骤三中的转氨酶粗品中加入混合溶液,进行搅拌,搅拌后进行离心,离心后再去除上清,得到成品转氨酶固体后进行真空冷冻干燥保存即可。2.根据权利要求1所述的一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,其特征在于:所述步骤一中的菌体细胞为:一株产谷氨酰胺转氨酶转基因菌株以4%的接种量接入种子培养基,在8℃,210r/min条件下培养48h后得到的菌体细胞。3.根据权利要求1所述的一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,其特征在于:所述步骤一、步骤二、步骤三和步骤四中的离心均为密度梯度离心法,所述步骤一、步骤二、步骤三和步骤四均在10℃温度下完成。4.根据权利要求1所述的一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,其特征在于:所述步骤一中先将菌体细胞放入离心机内,控制离心机内的离心加速度为8000G,离心时间为5min,再进行去除上清,得到菌泥。5.根据权利要求1所述的一种具有催化活性的转氨酶的提取方法,其特征在于:所述步骤一中先将一株产谷氨酰胺转氨酶转基因菌株以4%的接种量接入种子培养基,在8℃,210r/min条件下培养24h后得到一种具有催化活性的转氨酶菌体细胞,再将菌体细胞放入离心机内,控制离心机内的离心加速度为8000G,离心时间为5min,再进行去除上清,得到菌泥,再向菌泥内加入2倍体积PH值为7.4的磷酸缓冲溶液进行搅...

【专利技术属性】
技术研发人员:叶质强周拥军冯露鄂松王心洁
申请(专利权)人:湖北省宏源药业科技股份有限公司
类型:发明
国别省市:湖北,42

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