本发明专利技术提供了一种7β‑羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用。对来源于产气柯林斯菌的7β‑羟基类固醇脱氢酶进行突变，获得的突变体Ca7β‑2的还原活力提高了7.6倍，还原氧化活力比值提高了4倍，在浓度为100mM的UDCA条件下孵育1小时，活力仅下降了8.4％；在30℃，pH8.0条件下催化合成UDCA和T‑UDCA，转化时间由24小时缩短到2小时，其中底物7‑KLCA的摩尔转化率为100％，底物T‑7‑KLCA摩尔转化率为99.5％。突变后的7β‑HSDH极大程度地降低了生产成本，提高了生产效率，更适合于工业化应用。
【技术实现步骤摘要】
一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用
本专利技术属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及它们在制备熊去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸中的应用。
技术介绍
熊去氧胆酸(UDCA)和牛磺熊去氧胆酸(T-UDCA)是名贵中药——“熊胆粉”的主要有效成分，目前已应用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有明显的疗效。UDCA和T-UDCA传统的制备方法是从熊胆汁中提取，但这种方法提取过程困难、产物收率低、手段过于残忍，有违动物保护法。当前，工业上生产UDCA和T-UDCA的方法除了“熊胆提取法”外，主要有化学合成法和酶法，其中化学合成法由于成本较高、工艺步骤多、“三废”严重和条件苛刻等缺点已逐步被淘汰；而酶法具有成本较低、工艺简单、绿色无污染及反应条件温和等优点，因此日益受到重视。酶法生产UDCA或T-UDCA主要是利用7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hydroxysteroiddehydrogenase，7β-HSDH，EC1.1.1.201)催化7-酮石胆酸(7-KLCA)和牛磺-7-酮石胆酸(T-7-KLCA)7位上的酮基加氢变成羟基，从而得到这2种重要的医用原料药。野生型7β-羟基类固醇脱氢酶来源十分广泛，目前，国内外科研工作者已经筛选出众多产7β-羟基类固醇脱氢酶的微生物并将其编码基因克隆出来，如活泼瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)、扭链瘤胃球菌(RuminococcustorquesATCC35915)、产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)、撒丁岛梭菌(Clostridiumabsonum)等。但是这些野生型菌株普遍存在活性偏低，受产物UDCA或T-UDCA反馈抑制严重等缺点。随着基因工程、蛋白工程、酶工程和生物信息技术的发展，许多科研工作者运用理性设计、半理性设计和定向进化等手段对野生型7β-羟基类固醇脱氢酶进行突变改造。如中国专利CN105274070A中，刘志斌等对来源于活泼瘤胃菌属的7β-HSDH进行突变，其突变子RU-8C2和RU-4F9的活力由野生型的5.1U/ml提高到9.5U/ml和16.6U/ml，其对应的氨基酸残基变化分别为T210N和L3M/T219N。如中国专利CN106636285A中，傅荣昭等对来源于Turneriellaparva的野生型7β-HSDH进行突变，突变体V38R+V39R活力由254.8U/ml提高到412.8U/ml，其反应温度由25℃提高到30℃，酶液投量和NADP+投量显著降低。MingminZheng等(J.Agric.FoodChem.,2017,65(6),pp1178–1185)对来源于RuminococcustorquesATCC35915的7β-HSDH进行突变，他们采用易错PCR和DNA重排的定向进化手段，其突变子V3-1由野生型的8.60μmol/min/mg提高到51.4μmol/min/mg，比活由21.9U/mg提高到41.8U/mg，对应的氨基酸残基为T189V/V207M。虽然，国内外科研工作者利用基因工程及蛋白工程技术对7β-羟基类固醇脱氢酶进行突变改造，使其活性有了成倍的提高，但是，突变酶的活力依旧偏低、受产物抑制依旧很严重。因此，开发一种还原活力高、还原氧化活力比值高及产物抑制弱的酶具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术首要目的在于提供一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，以解决制备熊去氧胆酸或牛磺熊去氧胆酸时，野生型酶的还原活力偏低、氧化活力偏高、还原氧化活力比值偏小和受产物反馈抑制严重，反应时间长等技术问题。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供的技术方案之一是：提供一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。本专利技术中利用易错PCR技术对产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)来源的野生型7β-羟基类固醇脱氢酶进行定向改造，以获得还原活力高，还原氧化活力比值大及受产物反馈抑制作用弱的突变体。一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，至少将具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列第175位的谷氨酸突变成天冬氨酸。进一步的，将具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列第175位的谷氨酸突变成天冬氨酸，该突变体命名为Ca7β-1，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。该突变体比野生型的7β-羟基类固醇脱氢酶还原活力高。一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，至少将具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列第175位和第197位的谷氨酸均突变成天冬氨酸。进一步的，将具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列第175位和第197位的谷氨酸均突变成天冬氨酸该突变体命名为Ca7β-2，其氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。该突变体的还原活力高，还原氧化活力比值大及受产物反馈抑制作用弱，使得反应时间大幅缩短，且能将底物7-KLCA或T-7-KLCA转化完全。本专利技术第二个目的在于提供上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因序列。本专利技术提供的技术方案之二是：提供一种编码7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因序列，为编码上述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体中的任一种的基因序列。所述编码基因序列的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法包括：(1)从自然界中提取；(2)通过基因克隆技术获得；(3)通过人工全基因合成中的任一种。如本领域技术人员所知：所述编码基因序列在不影响表达功能的前提下可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加碱基来制得。进一步地，所述编码7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因序列如序列SEQIDNO.3所示；更进一步地，所述编码7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因序列如序列SEQIDNO.5所示。本专利技术第三个目的在于提供上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因序列的重组表达载体。本专利技术提供的技术方案之三是：提供一种含有上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因序列中的一种或几种的重组表达载体。所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本专利技术所述的编码基因序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本专利技术所述载体优选原核表达载体pET30a(+)。本专利技术第四个目的在于提供上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因序列重组表达载体的基因工程菌。本专利技术提供的技术方案之四是：提供一种包含有上述重组表达载体的一种或几种的基因工程菌。所述重组表达基因工程菌的制备方法为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。其中所述宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。将上述重组表达载体通过电转化或者化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，即可得本专利技术优选的重组基因工程菌。本专利技术的第五个目的是提供上述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，包括：使用上述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化7-酮石胆酸制备熊去氧胆酸，或者使用上述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体催化牛磺-7-酮石胆酸制备牛磺熊去氧胆酸。进一步的，催化反应中用到的辅酶NADPH是由葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖合成得到的，反应完后NADPH转变成NADP+，N本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种7β‑羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，至少将具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第175位的谷氨酸突变成天冬氨酸。
【技术特征摘要】
1.一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，至少将具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列第175位的谷氨酸突变成天冬氨酸。2.根据权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，将具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列第175位的谷氨酸突变成天冬氨酸，该突变体命名为Ca7β-1，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。3.一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，至少将具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列第175位和第197位的谷氨酸均突变成天冬氨酸。4.根据权利要求3所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，将具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列第175位和第197位的谷氨酸均突变成天冬氨酸该突变体命名为Ca7β-2，其氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。5.一种编码7β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因序列，其特征在于，为编...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄斌，周晶辉，赵强，许岗，
申请(专利权)人：湖南福来格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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