猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用，属于医药技术领域。本发明专利技术所述的猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株是在猪伪狂犬病病毒BJ株的基础上，通过敲除gE和gI双基因构建得到的；其中，所述的猪伪狂犬病病毒BJ株，命名为BJ，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15911。实验证明，使用本发明专利技术制备得到的猪伪狂犬病灭活疫苗免疫初产健康猪用于预防猪伪狂犬病，具有安全、产生抗体快、免疫期持久等优点。并且能够与相应的DIVA(能区分感染与免疫动物)战略相匹配，在猪伪狂犬病防治领域将具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株及其构建方法和应用，特别涉及一种猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用。本专利技术属于医药

技术介绍
猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的高死亡率的急性传染病。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属。伪狂犬病毒能感染多种宿主，但猪是该病毒的主要天然宿主、贮存者和传播者。猪伪狂犬病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％。PRV为α疱疹病毒科、水痘病毒属成员，其基因组为线性双股DNA，由独特的长区段(UL区)、独特的短区段(US区)、内部重复序列(IR)和末端倒转重复序列(TR)构成。PRV基因组约含70～100个编码蛋白质基因，其中gE、gI、gC、TK、PK等基因与PRV毒力相关且为PRV增殖非必需基因。gE、gI与PRV嗜神经性和在神经系统中传播有关，通过形成的异源二聚体发挥作用。我国猪场自20世纪末开始使用伪狂犬基因缺失疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等疑似伪狂犬的临床症状并产生严重的经济损失。有关研究学者对多个省份免疫猪场的临床样品进行了PRV野毒的分离鉴定、gE基因序列分析及血清中和试验，结果初步表明新分离PRV流行毒株较以往毒株发生明显变异，对小鼠、猪的致病性明显增强；发病仔猪出现瘙痒症状，嗜内脏组织性增强。因此，研制针对此次再发流行毒株的疫苗，十分必要。目前，免疫接种是PR防控的主要措施。目前，我国应用较多的是BarthaK61弱毒疫苗株，同时可应用gE抗体ELISA方法和基于PRVgE基因建立的荧光定量PCR等PCR方法来区分感染动物和免疫动的区分。根据检测和监测结果，逐渐实现从猪群中清除PRV野毒感染动物并逐步实现PRV的净化。因此，一方面研制针对PRV变异毒株的候选疫苗株；另一方面，候选疫苗株的应用要与相应的DIVA(能区分感染与免疫动物)战略相匹配，所以以PRV变异毒株为亲本构建基因缺失病毒是必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够配合PRV净化的DIVA战略的用于防治国内流行PRV变异毒株的PRV疫苗株及其用途。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术专利技术人用ST细胞从河北、东北、北京等地的猪场送检的疑似猪伪狂犬病发病猪病料中分离获得6株伪狂犬病毒，对6株PRV病毒进行PCR鉴定和gB、gE基因序列测定分析，结果发现6株病毒均与近几年分离的变异株病毒亲缘关系较近，为变异株猪伪狂犬病毒。动物回归试验显示，6株病毒均可引起小鼠、家兔发病或死亡。经仔猪接种试验，分离的BJ株毒力最强。通过后期的试验结果表明其免疫原性良好，可作为疫苗研究的候选毒株。为了配合PRV净化的DIVA战略，进一步的，本专利技术专利技术人以亲本毒株PRVBJ株构建gE/gI双基因缺失毒株(BJ-ΔgE/gI株)。为顺利敲除gE/gI基因，首先构建包含EGFP表达盒的PRV打靶载体(pMD-ΔgE/gI-L-EGFP-R)，利用同源重组技术构建了PRVBJ-ΔgE/gI-EGFP株。获得纯化PRVBJ-ΔgE/gI-EGFP株病毒后，利用构建的敲除EGFP表达盒的打靶载体(pMD-ΔgE/gI-LR)通过同源重组删除EGFP表达盒获得gE/gI双基因缺失毒株(BJ-ΔgE/gI株)。通过基因敲除手段去除了BJ株的致病基因获得BJC株，为了考察BJC株对仔猪的致病力，进行了攻毒试验。结果显示，仔猪均没有出现伪狂犬临床症状，剖检，亦未见明显病理变化。用2～3周龄PRVPCR抗原检测为阴性、中和抗体效价不高于1∶4的健康仔猪，对猪伪狂犬病毒BJC株的最小免疫剂量进行了测定。结果表明：以0.5ml疫苗免疫仔猪，免疫后21日加强免疫一次，攻毒保护率为80％；以1ml以上剂量的疫苗免疫仔猪，免疫后21日加强免疫一次，攻毒保护率为100％；对照组100％发病。说明猪伪狂犬病毒BJC株最小免疫剂量为1ml(107.5/ml)。在上述研究的基础上，本专利技术提出了一种猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株，所述的猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株是在猪伪狂犬病病毒BJ株的基础上，通过敲除gE和gI双基因构建得到的；其中，所述的猪伪狂犬病病毒BJ株，命名为BJ，分类命名为猪伪狂犬病病毒，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.15911，保藏日期为2018年7月11日。进一步的，本专利技术还提出了一种构建所述的猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株的方法，包括以下步骤：(1)pEGFP-C1质粒改造利用BspEI和BamHI限制性内切酶酶切pEGFP-C1质粒，回收大片段，将该大片段转化DH5α感受态细胞，得到的改造后的质粒命名为pMEGFP-C1；(2)左右同源臂的扩增利用两对引物，以PRVBJ株DNA为模板进行PCR扩增，得到左右同源臂；用于左侧同源臂扩增的引物为：上游引物：ATgaattcTGGCGCTGATCTCCGACC下游引物：GCattaatGCAGCGTCCCGTCTATCGT用于右侧同源臂扩增的引物为：上游引物：CGacgcgtTGCCCACGCACGAGGACTA下游引物：CCctcgagGGTGGAGGCGGTGGAGAAGA(3)含有EGFP表达盒的转移载体构建将改造的pMEGFP-C1质粒用AseI和MluI两个限制性内切酶进行酶切，回收1584bp大小片段，将左同源臂用EcoRI和AseI进行双酶切；将右同源臂用MluI和XhoI进行双酶切，分别回收酶切后的左右同源臂；将pMD18-T载体用EcoRI和XhoI进行双酶切后回收大片段；将回收的4个片段用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，挑菌，鉴定，构建成功的质粒命名为pMD-ΔgE/gI-L-EGFP-R；(4)敲除EGFP表达盒的转移载体的构建利用两对引物，以PRVBJ株DNA为模板进行PCR扩增，得到左右同源臂；用于左侧同源臂扩增的引物为：上游引物：ATgaattcTGGCGCTGATCTCCGACC下游引物：GCacgcgtGCAGCGTCCCGTCTATCGT用于右侧同源臂扩增的引物为：上游引物：CGacgcgtTGCCCACGCACGAGGACTA下游引物：CCctcgagGGTGGAGGCGGTGGAGAAGA分别用EcoRI、MluI和MluI、XhoI对得到的左右同源臂进行双酶切，将pMD18-T用EcoRI和XhoI进行双酶切，酶切后回收大片段；将回收的3个DNA片段用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，挑菌，鉴定，构建成功的质粒命名为pMD-ΔgE/gI-L-R；(5)含有EGFP表达盒的gE/gI双基因缺失株疫苗株的拯救将构建的转移载体pMD-ΔgE/gI-L-EG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株，其特征在于，所述的猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株是在猪伪狂犬病病毒强毒株BJ株的基础上，通过敲除gE和gI双基因构建得到的；其中，所述的猪伪狂犬病病毒强毒株BJ株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15911，保藏日期为2018年7月11日。

【技术特征摘要】
1.猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株，其特征在于，所述的猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株是在猪伪狂犬病病毒强毒株BJ株的基础上，通过敲除gE和gI双基因构建得到的；其中，所述的猪伪狂犬病病毒强毒株BJ株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.15911，保藏日期为2018年7月11日。2.一种构建权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)pEGFP-C1质粒改造利用BspEI和BamHI限制性内切酶酶切pEGFP-C1质粒，回收大片段，将该大片段转化DH5α感受态细胞，得到的改造后的质粒，命名为pMEGFP-C1；(2)左右同源臂的扩增利用两对引物，以PRVBJ株DNA为模板进行PCR扩增，分别得到左右同源臂；用于左侧同源臂扩增的引物为：上游引物：ATgaattcTGGCGCTGATCTCCGACC下游引物：GCattaatGCAGCGTCCCGTCTATCGT用于右侧同源臂扩增的引物为：上游引物：CGacgcgtTGCCCACGCACGAGGACTA下游引物：CCctcgagGGTGGAGGCGGTGGAGAAGA(3)含有EGFP表达盒的转移载体构建将改造的pMEGFP-C1质粒用AseI和MluI两个限制性内切酶进行酶切，回收1584bp大小片段，将左同源臂用EcoRI和AseI进行双酶切；将右同源臂用MluI和XhoI进行双酶切，分别回收酶切后的左右同源臂；将pMD18-T载体用EcoRI和XhoI进行双酶切后回收大片段；将回收的4个片段用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，挑菌，鉴定，构建成功的质粒命名为pMD-ΔgE/gI-L-EGFP-R；(4)敲除EGFP表达盒的转移载体的构建利用两对引物，以PRVBJ株DNA为模板进行PCR扩增，得到左右同源臂；用于左侧同源臂扩增的引物为：上游引物：ATgaattcTGGCGCTGATCTCCGACC下游引物：GCacgcgtGCAGCGTCCCGTCTATCGT用于右侧同源臂扩增的引物为：上游引物：CGacgcg...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔宇润，
申请(专利权)人：北京康谷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11