一种甘蔗体细胞杂交的方法技术

本发明专利技术属于植物体细胞杂交技术领域，具体涉及一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：(1)亲本原生质体的制备；(2)原生质体的钝化；(3)原生质体融合诱导物的添加：其中一种亲本原生质体一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种亲本原生质体等体积混合得到混合原生质体；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体进行电融合。本发明专利技术利用硅与植物细胞膜表面的糖脂具有很高的亲和力的原理，两种亲本原生质体在硅的诱导下融合，达到提高一对一融合率的作用，杂交后代同时具有ROC22甘蔗高产高糖、高耐旱性的基因，同时具有GT28甘蔗的高糖耐寒基因。

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗体细胞杂交的方法
本专利技术属于植物体细胞杂交
，具体涉及一种甘蔗体细胞杂交的方法。
技术介绍
植物原生质体包括细胞核、细胞质和细胞膜，是指除去植物细胞壁后得到的有活力的部分。在适合的培养条件下，离体的植物原生质体能够繁殖分化再生成完整的植株。因去掉了细胞壁的保护，细胞膜的流动性能够得以完整的体现，通过植物原生质体融合而进行的植物体细胞杂交育种技术正是依赖于细胞膜的流动性。而且这种育种方法可以缩短育种年限，还可以克服远缘杂交不亲和的障碍。所以植物体细胞杂交育种技术一直是近些年的研究热点，在品种改良中具有广阔的应用前景，为杂交育种带来了无限的可能。广西作为全中国的甘蔗产量第一大省，是中国最大的甘蔗生产基地，为中国糖料生产做积累和储备。随着生活和社会需求，需要更多的糖料储备，就需要我们提高制糖工业，首要的前提就是甘蔗的产量质量要有质的提高。然而，广西目前还未能培育出高糖高产量，同时又具有抗逆性强的甘蔗品种。新台糖22号是广西甘蔗的当家品种，具有高萌芽率、高分蘖率、高产高糖、高耐旱性等特点的种植性状，但这个品种的耐寒性差，而桂糖28号具有高糖耐寒、抗逆性强、适应性广等特性，研发一种集以上两个甘蔗品种的优良基因于一身的新品种很有必要，目前鲜少有看到甘蔗体细胞融合成功的实验案例。目前，细胞融合虽然取得了一些实质性的成就，但是如何提高一对一融合率仍是努力研究的方向。
技术实现思路
鉴于上述内容，有必要提供一种甘蔗体细胞杂交的方法，该方法具有提高甘蔗两个亲本融合率的作用。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5-7mmol/L的IOA溶液中17-22min，另一种于室温下悬浮于45-55μg/mL的R-6G溶液中17-22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105-6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.55-0.75mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养10-15min后取出；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150-250V·cm-1、交流频率为450-650kHz、持续时间100-300s、直流脉冲场强为1.5-2.5kV·cm-1、脉冲宽度为30-50μs以及脉冲次数1-3个。在本专利技术中，进一步的说明，步骤(1)所述亲本制备原生质体的方法为：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.5-0.8g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有4.5-5.5L含13％甘露醇的13％CPW溶液的容器中进行密封处理27-33min，接着分别抽去两个容器中的13％CPW溶液；接着用含9％甘露醇的9％CPW溶液清洗两个容器内的组织片2-3次；接着按重量份往两个容器中分别加入4.5-5.5mL酶液，分别封好封口膜后放到摇床里，于黑暗条件下以35-45r/min的转速酶解3-4h，得到两种亲本的酶解产物，分别将两种酶解产物分离纯化，收集沉淀物分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I。在本专利技术中，进一步的说明，所述分离纯化的方法为：将两种亲本酶解产物分别依次过60-80目筛和180-200目筛，并收集两种亲本的原生质体粗溶液；接着将两种亲本的原生质体粗溶液分别以450-550r/min的速度进行第一次离心处理，离心时间为4-6min，分别收集两种沉淀物，得到第一ROC22甘蔗原生质体沉淀和第一GT28甘蔗原生质体沉淀；按重量份分别往两种亲本的原生质体沉淀物中加入3-5份的9％CPW溶液，混匀后分别进行第二次离心处理，离心时间为4-6min，离心速度为450-550r/min，分别收集两种沉淀物，得到第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀；接着将第二ROC22甘蔗原生质体沉淀和第二GT28甘蔗原生质体沉淀重复第二次离心的步骤2-3次。在本专利技术中，进一步的说明，步骤(2)所述洗涤的方法为：将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别离心洗涤两次，其中，每次离心速度为750-850r/min，离心时间为4-6min。在本专利技术中，进一步的说明，步骤(3)中所述硅酸盐水溶液选自硅酸钠水溶液。在本专利技术中，进一步的说明，步骤(4)中，在进行电融合前，先使混合原生质体在融合液中预平衡3-4min。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术具有提高甘蔗两个亲本融合率的作用，具体原理为:硅与植物细胞膜表面的糖脂具有很高的亲和力，并且对植物细胞不但无害，还具有诸多益处，基于此，先用硅酸钠水溶液培养其中一种亲本原生质体，再将表面附着硅的亲本原生质体与另一种亲本原生质体混合，两种亲本原生质体在硅的诱导下融合，达到提高原生质体一对一融合率的作用，杂交后代具有ROC22甘蔗高产高糖、高耐旱性的基因，同时具有GT28甘蔗的高糖耐寒基因；同时硅具有促进原生质体表面细胞壁的再生，因而可促使融合后的两亲本原生质体形成细胞壁，形成完整的细胞，从而为后面细胞分裂、原生质体就形成细胞团、再进一步诱导出植株提供良好的基础。试验结果显示，采用本专利技术的方法ROC22甘蔗和GT28甘蔗的原生质体一对一融合率高达29.46％，相比于原生质体不用植物凝集素可以和生物素的对照组高出13.29％；完成融合试验后，其原生质体经培养，其植板率达52.18％。【具体实施方式】本专利技术提供了提供一种甘蔗体细胞杂交的方法，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本专利技术提供的甘蔗原生质体电融合的方法如下：一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：(1)制备原生质体：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.5g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有4.5L含13％甘露醇的13％CPW溶液的容器中进行密封处理27min，接着分别抽去两个容器中的13％CPW溶液；接着用含9％甘露醇的9％CPW溶液清洗两个容器内的组织片2次；接着按重量份往两个容器中分别加入4.5mL酶液，分别封好封口膜后放到摇床里，于黑暗条件下以35r/min的转速酶解3h，得到两种亲本的酶解产物，分别将两本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蔗体细胞杂交的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5‑7mmol/L的IOA溶液中17‑22min，另一种于室温下悬浮于45‑55μg/mL的R‑6G溶液中17‑22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105‑6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.55‑0.75mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养10‑15min后取出；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150‑250V·cm‑1、交流频率为450‑650kHz、持续时间100‑300s、直流脉冲场强为1.5‑2.5kV·cm‑1、脉冲宽度为30‑50μs以及脉冲次数1‑3个。...

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗体细胞杂交的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5-7mmol/L的IOA溶液中17-22min，另一种于室温下悬浮于45-55μg/mL的R-6G溶液中17-22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105-6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.55-0.75mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养10-15min后取出；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150-250V·cm-1、交流频率为450-650kHz、持续时间100-300s、直流脉冲场强为1.5-2.5kV·cm-1、脉冲宽度为30-50μs以及脉冲次数1-3个。2.根据权利要求1所述的一种甘蔗体细胞杂交的方法，其特征在于：步骤(1)所述亲本制备原生质体的方法为：分别称取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶各0.5-0.8g，并分别将幼苗嫩叶切成大小一致的组织片；接着分别将以上两个亲本组织片置于装有4.5-5.5L含...

【专利技术属性】
技术研发人员：李素丽，宋亚妮，刘芳君，龙安四，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45