RGA法检测热原生物学活性制造技术

本发明专利技术公开了RGA法检测热原生物学活性，所述RGA法是基于转染NF‑κB报告基因的RAW264.7单核细胞系所建立的热原生物活性检测方法，该方法可以快速方便的检测多种类热原。本发明专利技术同时公开了检测热原生物活性的单克隆细胞株及其构建方法。

【技术实现步骤摘要】
RGA法检测热原生物学活性
本专利技术属于生物医药领域，涉及RGA法检测热原生物学活性。
技术介绍
热原是一类可致人体产生发热反应的物质，其可分为外源性热原与内源性热原。外热原主要来源于机体外的细菌、病毒、真菌类微生物，目前对其结构研究较为清楚的主要包括革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)也称为细菌内毒素、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)、真菌的酵母多糖(zymosan)。内热原主要来源于机体内的激素(如类固醇、前列腺素)与细胞因子(如肿瘤坏死因子、干扰素、生长因子、白细胞介素)。作为污染药品的常见杂质，热原可严重危害药品的安全性。目前，常用的热原检测方法包括家兔热原检查法(rabbitpyrogentest，RPT)与细菌内毒素检查法(bacterialendotoxinstest，BET)。RPT法存在的最大问题是兔与人对热原反应存在较大种属差异，不能真实反映人体对热原的发热反应机制。BET法存在的最大问题是其仅能特异性检测革兰氏阴性菌来源的细菌内毒素，不能检测其他种类的热原物质。发热反应是机体针对热原物质产生的系统性炎症反应，热原引起人体产生发热反应的机制主要包括2类通路：即前列腺素(prostaglandin，PEG)依赖性与PEG非依赖性通路。①PEG依赖性通路中，外热原先诱导机体产生促炎症因子，包括白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、CC趋化因子5(CCchemokineligand5，CCL5)、CXC趋化因子1(CXCchemokineligand1，CXCL1)，这些因子均可促进PGE2的分泌进而诱导发热反应。②PEG非依赖性通路中，热原效应因子(preformedpyrogenicfactor，PFPF)、CXCL8、CCL3为促炎症因子，这些因子分别通过PFPF→促皮质素释放因子(corticotropinreleasingfactor，CRF)→内皮素-1→内源性阿片肽，CXCL8→CRF，CCL3→CRF诱导发热反应。不同种类的热原刺激人体的机制及诱导人体分泌的促炎症因子存在不同：如①LPS主要结合Toll样受体4(Toll-likereceptor4，TLR4)，活化的TLR4主要经MyD88依赖性(MyD88→NF-κB→促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6合成)与TRIF依赖性(TRIF→NF-κB)通路引起促炎症反应。②LTA主要结合TLR2进而活化NF-kB引起TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NO、趋化因子等促炎症介质的产生。③酵母多糖可结合TLR2活化NF-κB进而诱导促炎症因子TNF-α、IL-1β、趋化因子IL-8的表达。本专利技术以炎症反应的中枢因子NF-κB为热原标志物，通过构建转染NF-κB报告基因的RAW264.7单核细胞系，研究该细胞模型中的NF-κB对不同种类热原(如LPS、LTA、zymosan)的反应活性，建立一种可全面反映人体对不同种类热原的发热反应机制，且快速简便、稳定准确的RGA热原检测法。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种能够快速简便的检测热原生物学活性的单克隆细胞株的构建方法。本专利技术的目的之二在于提供一种能够快速简便的检测多种热原生物学活性单克隆细胞株。本专利技术的目的之三在于提供一种快速简便、稳定准确的热原生物学活性检测报告基因法。本专利技术的目的之四在于提供一种筛选治疗发热候选药物的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面提供了一种测定热原生物活性的细胞株的构建方法，包括以下步骤：a.以含荧光素酶报告基因的质粒为载体，连接NF-κB的反应元件，构建含NF-κB基因启动子的重组质粒；b.将重组质粒转入RAW264.7细胞中，加压筛选分离培养出阳性单克隆细胞株；c.从阳性单克隆细胞株中筛选得到对热原具有较高反应活性的RAW264.7单克隆细胞株。进一步，所述NF-κB反应元件为3个。进一步，NF-κB反应元件的序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术中，所述质粒包括本领域技术人员的常用的质粒载体。作为一种优选的实施方式，所述质粒为pCM1.1_luc_hygro。本专利技术的第二方面提供了本专利技术第一方面所述的构建方法在制备RAW264.7单克隆细胞株中的应用。本专利技术第三方面提供了一种RAW264.7细胞株，所述细胞株由本专利技术第一方面所述的方法构建而成，在本专利技术的具体实施方式中，所述细胞株为RAW264.7-NFκB2D8。本专利技术的第四方面提供了本专利技术第三方面所述的RAW264.7细胞株在制备检测热原生物活性的产品中的应用。本专利技术的第五方面提供了一种新的热原生物活性的测定方法，所述方法通过使用本专利技术第三方面所述的RAW264.7细胞株进行检测，所述的RAW264.7细胞株转染NF-κB报告基因，当外源性热原刺激该细胞株时，NF-κB被活化，根据NF-κB的活化程度来判断热原的种类及浓度。为了探索热原生物活性测定的最优方法，本专利技术对热原刺激的时间以及细胞密度进行了摸索。作为可选择的实施方式中，热原刺激的时间为4-24h；作为优选的实施方式，热原刺激的时间为10h。作为可选择的实施方式，热原刺激的细胞密度为5000～150,000个/孔；作为优选的实施方式，细胞密度为100000个/孔。本专利技术的第六方面提供了本专利技术第三方面所述的RAW264.7细胞株在筛选治疗发热的候选药物中的应用。进一步，步骤包括：加入待筛选物质和热原处理含有RAW264.7细胞株的体系；检测所述体系中NF-κB的活性；其中，若NF-κB的活性较低或者无变化，这说明该待筛选物质是治疗发热的候选药物。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术首次提供了一种可检测多种热原生物活性的方法，该方法成本低，操作简便，周期短，不需要进行动物实验，结果稳定可靠，准确度高，有利于促进药品的研究开发，质量控制与临床应用，具有较高的应用价值。本专利技术提供了一种单克隆细胞株及其构建方法，使用该单克隆细胞株，可检测多种热原生物活性，具有较高的敏感性和准确性。附图说明图1是不同热原活化NF-κB的时间-效应关系图，其中图A是细菌内毒素，图B是脂磷壁酸，图C是酵母多糖；图2是不同细胞密度下细菌内毒素活化NF-κB的量效关系图；图3是NF-κB对不同热原的检测限与剂量反应曲线图；其中，图A是细菌内毒素，图B是脂磷壁酸，图C是酵母多糖；图4是内毒素样品溶液理论值与实测值的线性回归分析图。具体的实施方式本专利技术通过将三个串联的NF-κB反应元件构建报告基因质粒(Reportergene，R-G)转染RAW264.7细胞，通过加压筛选分离培养出单克隆细胞株，再建立相应的检测方法定量检测热原生物学活性。其技术流程为：RAW264.7/R-G细胞株的建立(报告基因载体单克隆细胞株)→RGA测定方法的建立及方法学验证。下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1RAW264.7单克隆细胞株的构建及筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定热原生物活性的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：a.以含荧光素酶报告基因的质粒为载体，连接NF‑κB的反应元件，构建含NF‑κB基因启动子的重组质粒；b.将重组质粒转入RAW264.7细胞中，加压筛选分离培养出阳性单克隆细胞株；c.从阳性单克隆细胞株中筛选得到对热原具有较高反应活性的RAW264.7单克隆细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种测定热原生物活性的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：a.以含荧光素酶报告基因的质粒为载体，连接NF-κB的反应元件，构建含NF-κB基因启动子的重组质粒；b.将重组质粒转入RAW264.7细胞中，加压筛选分离培养出阳性单克隆细胞株；c.从阳性单克隆细胞株中筛选得到对热原具有较高反应活性的RAW264.7单克隆细胞株。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述NF-κB反应元件为3个。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，NF-κB反应元件的序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述质粒为pCM1.1_luc_hygro。5.权利要求1-4任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军志，贺庆，于传飞，王兰，高华，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11