表达错义突变的FLNB基因的细胞模型、构建方法与应用技术

技术编号:20089027 阅读:126 留言:0更新日期:2019-01-15 08:09
本发明专利技术公开了一种表达突变的FLNB基因的细胞模型,所述表达错义突变的FLNB基因所用的细胞为ATDC5细胞。本发明专利技术充分表明FLNB基因的生理及病理性功能具有显著的细胞类型特异性,也解释了为何FLNB基因仅影响骨骼系统。本发明专利技术还提出了不同位点的错义突变通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡,导致彼此间互不相同的骨骼系统畸形的表型。

【技术实现步骤摘要】
表达错义突变的FLNB基因的细胞模型、构建方法与应用
本专利技术涉及生物医药领域,具体涉及一种表达错义突变的FLNB基因的细胞模型、构建方法与应用。
技术介绍
已有研究表明,非随机性分布的细丝蛋白B基因(FilaminB,FLNB)错义突变位点可导致一组常染色体显性遗传、继发于骨发育不良(bonehypoplasia)的骨骼畸形疾病,包括Larsen综合征(Larsensyndrome,LS)、骨发育不全症(atelosteogenesis,AO)、回飞镖样骨发育不全症(boomerangdysplasia,BD)。非随机分布的FLNB基因无义突变可以导致另外一种隐形遗传的骨骼畸形疾病,即脊柱-腕-跗骨融合症(spondylocarpotarsalsynostosissyndrome,SCT)。LS是位于该疾病谱中骨发育不良程度最低的一端,而BD则位于该疾病谱中骨发育不良程度最高的一端。LS表现出的骨骼畸形包括脊柱侧凸、颈椎后凸畸形、腕骨及跗骨增多、大关节的脱位和诸如前额突起、眼距增宽及鼻梁塌陷等畸形。BD是一种致死性骨发育不良疾病,其特征为肢体长骨、椎体及髋臼的发育不良,甚至是上述骨结构的缺损或完全缺失。脊柱-腕-跗骨融合症(spondylocarpotarsalsynostosissyndrome,SCT,OMIM272460),其典型表现为腕骨或跗骨的提前融合、及由椎体间融合导致的脊柱生长不平衡而进而引起的脊柱侧凸畸形。根据现有报道,FLNB基因突变对骨骼畸形的致病性机理包括长骨生长板骨化延迟、软骨细胞的迁移能力下降以及软骨细胞的增殖、分化及凋亡过程的紊乱。然而,这些研究中大部分都集中在出现数量较少的FLNB无义突变导致的SCT上,而对于出现数量较多的FLNB基因错义突变导致的疾病,则研究较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达突变的FLNB基因的细胞模型,该模型为研究错义突变的FLNB基因导致的疾病提供了研究基础。为实现上述目的,本专利技术首先提供一种表达突变的FLNB基因的细胞模型,其特征在于,所述表达突变的FLNB基因所用的细胞为ATDC5细胞。优选地,所述突变的FLNB基因包括含有突变位点c.4756G>A的FLNB基因、含有突变位点c.512T>G的FLNB基因、导致骨发育不良的突变基因、导致骨化中心提前融合的骨骼畸形疾病的突变基因或导致先天性脊柱侧凸的突变基因。优选地,所述FLNB基因不同位点的突变,通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡,可导致所述ATDC5细胞产生不同的的骨骼系统畸形的表型。本专利技术的第二方面提供了以上所述细胞模型的构建方法,包括如下步骤:(1)FLNB全长cDNA基因的5’端组装标记基因后进行扩增;(2)将步骤(1)中获得的基因进行位点c.4756G>A或位点c.512T>G的定点突变;(3)将步骤(2)中获得的突变基因与载体相连构建表达载体;(4)将步骤(3)获得的表达载体通过转染导入ATDC5细胞,经过筛选及鉴定得到稳定表达错义突变的FLNB基因的细胞模型。优选地,步骤(1)中所述标记基因为增强绿色荧光蛋白基因。优选地,步骤(2)中所述定点突变采用PCR诱导定点突变。优选地,所述PCR诱导定点突变所使用引物如下:FLNB-G4756A-F:ACAAGACTaGGCGCTATATGATTGGAGTCACCFLNB-G4756A-R:ATAGCGCCtAGTCTTGTCGGGGATGTAGGTGAFLNB-T512G-F:AAGACGGCAAAGCCCgGGGAGCCCTGGTAGACAGCTFLNB-T512G-R:CCGGGCTTTGCCGTCTTGCCAGTTCTGGTTAA。优选地,步骤(3)中所述载体为pCR3.1(-)载体。优选地,步骤(4)中所述转染使用jetPRIME转染试剂。本专利技术的再一个方面,提供以上所述的细胞模型的以下任一应用:(1)在作为Larsen综合征细胞模型上的应用;(2)在作为回飞镖样骨发育不全症细胞模型上的应用。本专利技术的有益效果如下:为研究FLNB突变位点的致病机理,选择一个合适的细胞模型是开展细胞学及分子生物学实验的必要前提。前人关于FLNB错义突变位点的致病机理研究进行的细胞实验部分主要是在HEK293细胞中开展,或许与该细胞对FLNB质粒具有较高的转染效率有关。但HEK293细胞系来源于肾脏,申请人认为该细胞系并不能准确地模拟骨骼发育过程,因此对于对骨骼系统具有高度特异性的FLNB基因,申请人认为该细胞系不是一个合适的细胞模型。本专利技术的表达突变的FLNB基因的细胞模型以ATDC5细胞为基础,由于ATDC5细胞是一个具有前软骨(prechondrogenic)干细胞性质的细胞系,因此通过ATDC5细胞可全面展现FLNB基因对骨组织的高度特异性,如细胞形态、细胞迁移能力、凋亡率的改变,这些现象只能在转染了FLNBL171R和FLNBG1586R突变质粒的ATDC5细胞中表现,而在转染了相同突变质粒的HEK293的细胞中并无表现。本专利技术的实验结果充分表明FLNB基因的生理及病理性功能具有显著的细胞类型特异性,也因此解释了为何FLNB基因仅影响骨骼系统。本专利技术还提出了不同位点的错义突变通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡,导致彼此间互不相同的骨骼系统畸形的表型。通过转染FLNBL171R和FLNBG1586R突变质粒的ATDC5细胞,模拟了BD和LS两种疾病的软骨内成骨过程的起始阶段,为FLNB在骨骼发育过程中的作用提供了新的研究方向。附图说明图1为本专利技术实施例1中的Westernblot结果图。图2为本专利技术实施例2中显微镜下ATDC5细胞中FLNB蛋白和肌动蛋白在胞浆中分布的情况图。图3本专利技术实施例2中显微镜下HEK293细胞中FLNB蛋白和肌动蛋白在胞浆中分布的情况图。图4-A为本专利技术实施例3中表达空载体的ATDC5细胞的细胞凋亡流式图;其中,早期凋亡细胞8.67%,晚期凋亡细胞5.05%。图4-B为本专利技术实施例3中表达FLNBWT的ATDC5细胞的细胞凋亡流式图;其中,早期凋亡细胞7.37%,晚期凋亡细胞4.48%。图4-C为本专利技术实施例3中表达FLNBL171R的ATDC5细胞的细胞凋亡流式图;其中,早期凋亡细胞18.74%,晚期凋亡细胞25.16%。图4-D为本专利技术实施例3中表达FLNBG1586R的ATDC5细胞的细胞凋亡流式图;其中,早期凋亡细胞6.44%,晚期凋亡细胞2.76%。图4-E为本专利技术实施例3中表达空载体、FLNBWT、FLNBL171R(与BD相关)和FLNBG1586R(与LS相关)的ATDC5细胞的细胞凋亡率统计柱状图。图5-A为本专利技术实施例3中表达空载体的HEK293细胞的细胞凋亡流式图;其中,早期凋亡细胞5.89%,晚期凋亡细胞7.71%。图5-B为本专利技术实施例3中表达FLNBWT的HEK293细胞的细胞凋亡流式图;其中,早期凋亡细胞4.77%,晚期凋亡细胞8.50%。图5-C为本专利技术实施例3中表达FLNBL171R的HEK293细胞的细胞凋亡流式图;其中,早期凋亡细胞本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种表达突变的FLNB基因的细胞模型,其特征在于,所述表达突变的FLNB基因所用的细胞为ATDC5细胞。

【技术特征摘要】
1.一种表达突变的FLNB基因的细胞模型,其特征在于,所述表达突变的FLNB基因所用的细胞为ATDC5细胞。2.如权利要求1所述的细胞模型,其特征在于,所述突变的FLNB基因包括含有突变位点c.4756G>A的FLNB基因、含有突变位点c.512T>G的FLNB基因、导致骨发育不良的突变基因、导致骨化中心提前融合的骨骼畸形疾病的突变基因或导致先天性脊柱侧凸的突变基因。3.如权利要求1或2所述的细胞模型,其特征在于,所述FLNB基因不同位点的突变,通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡,可导致所述ATDC5细胞产生不同的的骨骼系统畸形的表型。4.权利要求1至3中任一所述细胞模型的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)FLNB全长cDNA基因的5’端组装标记基因后进行扩增;(2)将步骤(1)中获得的基因进行位点c.4756G>A或位点c.512T>G的定点突变;(3)将步骤(2)中获得的突变基因与载体相连构建表达载体;(4)将步骤(3)获得的表达载体通过转染导入ATDC5细胞,经过筛选鉴定得到稳定表达...

【专利技术属性】
技术研发人员:徐启明邱贵兴吴志宏吴南
申请(专利权)人:中国医学科学院北京协和医院
类型:发明
国别省市:北京,11

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