基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法及其应用技术

基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法及其应用，它属于医药领域，本发明专利技术的目的是以“类器官”培养技术，采用微载体为支架材料，复合患者来源的肝癌细胞培养出细胞‑3D材料复合体，然后直接将细胞‑3D材料复合体接种于正常免疫小鼠皮下，构建体内患者来源的肝癌移植瘤模型，解决目前人肝癌移植瘤模型存在的采用裸鼠、SCID鼠等免疫缺陷小鼠，不易饲养，价格昂贵，成瘤率不高的问题；尤其是解决免疫缺陷小鼠人肝癌移植瘤模型无法反映机体免疫系统在肿瘤发生、发展过程中所起的重要作用的问题，及免疫缺陷小鼠人移植瘤模型存在成瘤周期长，临床急迫需要药物治疗患者的药敏需求。本发明专利技术应用于小鼠模型构建领域。

【技术实现步骤摘要】
基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法及其应用
本专利技术属于医药领域，具体地涉及一种医学肿瘤动物模型—基于“类器官”构建的患者来源的正常免疫小鼠肝癌移植瘤模型及建立该模型的方法，以及它们在医药领域和临床中的应用。
技术介绍
肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，其发病机制尚未完全阐明。肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高居全球前三位。术后5年生存率约10％-20％。治疗效果不尽人意，预后差。因此建立能够模拟临床特征的肝癌动物模型对于肝癌的研究意义重大。新进研究成果类器官(organoids)被评为2017年生命科学领域最有潜力的“年度技术”，类器官是一种微型的三维细胞培养模型，源自患者原发性肿瘤，并在实验室中进行培养。从类器官形成之初、到进行药物治疗之后，这些类器官在组织学、分子水平和功能上能够持续与来源肿瘤组织保持高度一致，很好地反映其特点。长期以来，人类肿瘤细胞系和移植瘤裸鼠动物模型一直作为肿瘤研究和抗癌新药的研发平台，然而，由于细胞系所形成的肿瘤缺少间质细胞，而间质细胞在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用，给肿瘤的基础研究和有效抗癌新药的研发造成极大困难，同时，上述肿瘤模型很难准确模拟临床患者的真实病情，难以满足临床前实验的需要。近年，国外学者将患者的新鲜肿瘤手术标本移植到免疫缺陷小鼠，建立了新的模型，命名为肿瘤患者来源的移植瘤(patient-derivedxenografts，PDXs)。这些模型成功地再现了患者肿瘤的分子生物学、组织学和病理学特点，但因裸鼠缺乏T细胞，SCID鼠同时缺乏T细胞和B细胞，它们存在免疫功能缺陷，难以阐明肿瘤发生、发展和转移与机体免疫的关系，更不适合研究肿瘤免疫治疗，也不是开发新型抗肿瘤药物的最理想模型。患者来源的正常免疫功能小鼠移植肿瘤模型，弥补了因免疫缺陷小鼠缺乏免疫细胞而不能准确模拟机体免疫系统对肿瘤的免疫攻击等重要缺点，从而更准确地还原患者肿瘤组织的分子生物学特点及肿瘤微环境，为研究肿瘤的发病机制和新药研发以及临床精准治疗打下良好基础。但是目前还没有相关的异种肿瘤正常免疫功能小鼠移植瘤模型。
技术实现思路
本专利技术的目的是以“类器官”培养技术，采用微载体(NMC2)为支架材料，复合患者来源的肝癌细胞培养出细胞-3D材料复合体，然后直接将细胞-3D材料复合体接种于正常免疫小鼠皮下，构建体内患者来源的肝癌移植瘤模型，从而解决目前人肝癌移植瘤模型存在的采用裸鼠、SCID鼠等免疫缺陷小鼠，不易饲养，价格昂贵，成瘤率不高的问题；尤其是解决了免疫缺陷小鼠人肝癌移植瘤模型无法反映机体免疫系统在肿瘤发生、发展过程中所起的重要作用的问题，以及免疫缺陷小鼠人移植瘤模型存在成瘤周期长(一般需要3-5个月)，难以解决临床急迫需要药物治疗患者的药敏需求。本专利技术的基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法，它是按照以下步骤进行的：一、获取人肝癌肿瘤细胞：取肝癌细胞和肝癌组织间质细胞，以含10％胎牛血清的DMEM、质量百分含量为1％青霉素和质量百分含量为1％链霉素的完全培养液将上述细胞混匀；若台盼蓝计数活细胞数>95％，则调整细胞浓度至2×107/mL，然后放入37℃、5％CO2培养箱；二、将微载体浸泡于体积百分含量为75％的酒精24h后，用1×PBS缓冲液清洗5遍，置于DMEM培养基中孵育24-48h；将步骤一得到的人原代肝癌细胞悬液与孵育好的微载体混合，在温度为37℃、5％CO2培养箱中培养24-48h，得到孵育后的细胞-微载体复合体；三、用1×PBS缓冲液清洗步骤二孵育后的细胞-微载体复合体4遍，再用1×PBS缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度至2×107/mL，调整微载体浓度至200ug～300ug/mL，得细胞-微载体混悬液，并置于冰上备用；将细胞-微载体混悬液注射于7-8周的正常免疫小鼠体内，体内植入20-30天后，即构建完成患者来源的肝癌移植瘤小鼠模型。本专利技术的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型是用于肝癌药物研发。本专利技术包含以下有益效果：本专利技术引入了肿瘤三维培养技术，利用“类器官”三维培养技术构建体内患者来源的肝肿瘤模型，主要是将原代肝肿瘤细胞接种于微载体(NMC2)支架材料上共同培养，然后直接将细胞-材料复合体注入正常免疫小鼠体内构建肿瘤模型。本专利技术利用“类器官”培养技术，以微载体(NMC2)为基底材料，复合患者来源的原代肝癌细胞接种于免疫功能正常小鼠(C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠)皮下成功构建了具有正常免疫功能的小鼠患者来源的肝癌移植肿瘤模型。与已有的免疫缺陷小鼠移植肿瘤模型相比，该模型可以更好的研究和进一步阐明肿瘤在免疫功能正常机体中发生、发展机制，同时也为抗癌药物研发提供了较以往更有价值的新的动物模型。本专利技术将患者来源的肝癌细胞-微载体复合体接种至免疫功能正常小鼠(C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠)，自接种后开始至第8-10天，小鼠摄食正常，活动状况好，一般在第10天开始，小鼠活动稍减少，但食欲，毛发，体质量无明显差异。在接种后8～10d即可触及肿瘤，成瘤率为80％(16/20只)，移植瘤形态相对规整，多为圆形或椭圆形，颜色以灰白色或灰红色为主。附图说明图1为荷瘤鼠大体观察图；图2为移植瘤大体观察图；图3为体外成功建立的人原代肝癌细胞三维培养体系图；图4为患者来源的肝癌移植瘤HE染色图；图5为患者来源的肝癌移植瘤免疫组织化学染色图；其中，A：CK8/18×200染色图；B：Hep×200染色图；C：Gpc-3×200染色图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法，它是按照以下步骤进行的：一、获取人肝癌肿瘤细胞：取肝癌细胞和肝癌组织间质细胞，以含10％胎牛血清的DMEM、质量百分含量为1％青霉素和质量百分含量为1％链霉素的完全培养液将上述细胞混匀；若台盼蓝计数活细胞数>95％，则调整细胞浓度至2×107/mL，然后放入37℃、5％CO2培养箱；二、将微载体浸泡于体积百分含量为75％的酒精24h后，用1×PBS缓冲液清洗5遍，置于DMEM培养基中孵育24-48h；将步骤一得到的人原代肝癌细胞悬液与孵育好的微载体混合，在温度为37℃、5％CO2培养箱中培养24-48h，得到孵育后的细胞-微载体复合体；三、用1×PBS缓冲液清洗步骤二孵育后的细胞-微载体复合体4遍，再用1×PBS缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度至2×107/mL，调整微载体浓度至200ug～300ug/mL，得细胞-微载体混悬液，并置于冰上备用；将细胞-微载体混悬液注射于7-8周的正常免疫小鼠体内，体内植入20-30天后，即构建完成患者来源的肝癌移植瘤小鼠模型。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的微载体是由可正电化有机复合多聚物组成，呈多层孔状条索样，相互交联卷曲形成有足够空间的“迷宫”样不规则结构。其它与具体实施方式一相同。该微载体孔径大小、表面正电荷密度、载体颗粒大小可通过化学合成调节，是纯有机化合物，不易污染，不含杂质，具有低免疫原性、生物兼融性及可代谢性等特点，可为细胞生长提供稳定的微环境。微载体内部足够的空间解决了细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、获取人肝癌肿瘤细胞：取肝癌细胞和肝癌组织间质细胞，以含10％胎牛血清的DMEM、质量百分含量为1％青霉素和质量百分含量为1％链霉素的完全培养液将上述细胞混匀；若台盼蓝计数活细胞数>95％，则调整细胞浓度至2×107/mL，然后放入37℃、5％CO2培养箱；二、将微载体浸泡于体积百分含量为75％的酒精24h后，用1×PBS缓冲液清洗5遍，置于DMEM培养基中孵育24‑48h；将步骤一得到的人原代肝癌细胞悬液与孵育好的微载体混合，在温度为37℃、5％CO2培养箱中培养24‑48h，得到孵育后的细胞‑微载体复合体；三、用1×PBS缓冲液清洗步骤二孵育后的细胞‑微载体复合体4遍，再用1×PBS缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度至2×107/mL，调整微载体浓度至200ug～300ug/mL，得细胞‑微载体混悬液，并置于冰上备用；将细胞‑微载体混悬液注射于7‑8周的正常免疫小鼠体内，体内植入20‑30天后，即构建完成患者来源的肝癌移植瘤小鼠模型。

【技术特征摘要】
1.基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、获取人肝癌肿瘤细胞：取肝癌细胞和肝癌组织间质细胞，以含10％胎牛血清的DMEM、质量百分含量为1％青霉素和质量百分含量为1％链霉素的完全培养液将上述细胞混匀；若台盼蓝计数活细胞数>95％，则调整细胞浓度至2×107/mL，然后放入37℃、5％CO2培养箱；二、将微载体浸泡于体积百分含量为75％的酒精24h后，用1×PBS缓冲液清洗5遍，置于DMEM培养基中孵育24-48h；将步骤一得到的人原代肝癌细胞悬液与孵育好的微载体混合，在温度为37℃、5％CO2培养箱中培养24-48h，得到孵育后的细胞-微载体复合体；三、用1×PBS缓冲液清洗步骤二孵育后的细胞-微载体复合体4遍，再用1×PBS缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度至2×107/mL，调整微载体浓度至200ug～300ug/mL，得细胞-微载体混悬液，并置于冰上备用；将细胞-微载体混悬液注射于7-8周的正常免疫小鼠体内，体内植入20-30天后，即构建完成患者来源的肝癌移植瘤小鼠模型。2.根据权利要求1所述的基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法，其特征在于所述的微载体是由正电化有机复合多聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪丰，毕研贞，潘红娜，王全全，张凯，谌通，张凤梅，
申请(专利权)人：上海美峰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31