一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法技术

本发明专利技术公开了一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法。通过胎肝单细胞悬液制备，胎肝HSCs移植的操作步骤，本发明专利技术的方法能高效重建血液系统，造血安全、稳定、可靠，且能高质量地对地贫小鼠进行有效治疗，治疗后的血液学参数，病理学指标接近于正常个体，这对于未来临床开发胎肝造血干进行血液性等疾病的高效治疗储备了技术体系基础。

【技术实现步骤摘要】
一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法
本专利技术属于造血干细胞制备
，具体涉及一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法。
技术介绍
造血干细胞(Hematopoieticstemcells，HSCs)是可自我更新并能向各系血细胞分化的一类细胞。HSCs移植可对恶性血液病、遗传代谢性疾病和先天性免疫缺陷等相关疾病进行治疗。目前造血干细胞的来源主要是骨髓HSCs和脐带血HSCs，但供体细胞来源紧张，致使可受治患者的数量极其有限，因此探寻新型的可移植造血干细胞具有迫切的临床需求性。HSCs除了个体体内获取，其它研究较多的是通过多能性干细胞体外分化形成，或通过体细胞的转分化形成。但体外分化或转分化方式目前均不能有效的得到具有移植造血重建功能的HSCs。这是因为在胚胎发育过程中，造血细胞如何形成？在其形成的调控机制还未阐明。8.5-9.5d小鼠胚胎卵黄囊的造血岛开始发生原始造血，随后造血区域转移至主动脉-性腺-中肾，其它的研究则发现这一时期的胎盘、头部和脐动脉中也出现造血干细胞。10.5d后胎肝造血开始发生，16d后，胎肝造血逐渐向骨髓髓内造血变化。刘兵团队在胚胎早期成功地获得了造血干细胞前体(pre-HSC)，并经分析鉴定，CD201为这类细胞的表面标记，随后他们与兰雨课题组今年在cellresearch杂志上首次揭示出在在小鼠胚胎发育的过程中，AGM区HSCs及其前体细胞的功能具有异质性，这种功能不同的细胞具有时空差异特征，其中淋系髓系平衡型(β型)具有较高的自我更新能力和造血重建潜能，这些突破性的研究为探寻胚胎发育早期主要功能性造血重建的HSCs类型及造血干相关的再生医学提供了理论论据。13.5天胎龄的小鼠胎肝中含有丰富不同分化阶段的肝干细胞、HSCs和间充质干细胞，相比较骨髓HSCs，其造血体系可能含有增殖分化潜能更强的HSCs，且整个体系的免疫原性和免疫活性更低。且由于其造血区域相对集中，因此研究胚胎期髓外造血、挖掘具有造血功能作用的胎肝细胞，以及分析微环境支持细胞对于造血形成和造血维持的调控作用，对于进一步分析造血形成机制及造血干细胞的开发应用均有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法。一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法，按照如下步骤进行：(1)胎肝单细胞悬液制备：取哺乳动物胎肝，用枪头打碎成单细胞，细胞滤器过滤，除去细胞团块，用Ficoll分离液分离出单核细胞；(2)胎肝HSCs移植：配置单核细胞悬液，通过骨髓腔内注射方法，对受体进行骨髓腔内注射。所述哺乳动物为人，鼠，猴，牛或羊。所述单核细胞悬液的注射量为1×105/20ul-1×107/20ul。本专利技术的有益效果：本专利技术用密度梯度离心法，分离获得的红系高表达GFP的转基因小鼠13.5天胎肝或WT小鼠的单核细胞作为供体细胞，采用IBMI移植方法，对137Cs照射的野生型小鼠进行造血系统重建的研究。移植7天后，荧光镜检小鼠骨髓涂片和血液涂片可观察到GFP+的细胞，表明供体细胞已经随着骨髓和血液系统的被运输到全身各处，并有效地向血系细胞分化。通过血涂片周期性镜检观察，可能看到HS23胎肝供体细胞在第5周外周血GFP荧光细胞最多，说明造血此时或之前形成高峰，说明造血功能开始稳定。为有效治疗α或β地中海贫血、骨髓障碍性贫血、重症免疫缺陷等疾病开辟了新的方案。附图说明图1为移植后7dGFP胎肝造血干细胞来源细胞在体内存活及迁移(骨髓涂片)；图中，A-注射侧股骨骨髓；B-对侧股骨骨髓；C-胸骨骨髓。图2为13.5天小鼠胎肝HSCs移植后血涂片荧光镜检动态图。图3为654小鼠胎肝HSCs移植2个月后血涂片。图4为654小鼠致死量辐射注45.1/2E13.5FLMNC2月后嵌合率。图5为654小鼠亚致死量辐射注E13.5FLMNC的组织病理学分析；图中，A-C：骨髓涂片Wright-Giemsa染色(200×)脾脏和肝脏含血铁黄素染色(40×)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1实验动物：HG转基因小鼠：红系高表达GFP转基因小鼠，用此小鼠的胎肝作为供体细胞，通过示踪外周血GFP+细胞或DNAPCR鉴定骨髓细胞中GFP基因，可探测到供体细胞在血液中的动态比例变化及骨髓细胞中的嵌合情况。与C57与C57交配，获得的E13.5胎鼠的胎肝,进行Ficoll分离获得的单核细胞作为供体细胞。受体为45.1/2小鼠。C57小鼠：部分胎肝供体小鼠和胎肝HSCs移植的受体小鼠。45.1/1小鼠，购自上海南方模式动物中心，与C57交配，获得的E13.5胎鼠的胎肝,进行Ficoll分离获得的单核细胞作为供体细胞。受体小鼠：654地贫小鼠，购自Jakeson公司。试剂：hematoxylin-eosin(BASOBA4025,Zhuhai,China)；苏木素-伊红染色液(BASOBA4003)；瑞氏-姬母萨染色液(BASOBA40170)。方法：1.胎肝单细胞悬液制备：取13.5天HG小鼠或C57小鼠胎肝，用枪头打碎成单细胞，细胞滤器过滤，除去细胞团块。用Ficoll分离液分离出单核细胞。2.受体小鼠准备：复旦大学放射研究所放射科进行137Cs，6.5Gy(9Gy)亚致死量(致死量)辐照10min，进行半清髓(清髓)。3.胎肝HSCs移植：1×107/20ul、1×106/20ul和1×105/20ul悬液，通过骨髓腔内注射方法，对受体小鼠右肢胫骨进行骨髓腔内注射(intra-bonemarrowinjection，IBMI)。4.受体小鼠血液学检测：定期采集外周血进行血常规检测，制备血涂片瑞氏-姬母萨染色，血涂片镜镜检观察。约8周后处死，制备骨髓涂片，瑞氏-姬母萨染色，镜检。5.GFP及SRYDNA定量PCR检测移植鼠中供体细胞嵌合率。6.受体小鼠组织病理组织切片制备及镜检：受体小鼠移植后8周处死，取肝、心、脾等组织器官进行石蜡切片HE染色，镜检。步骤2亚致死量辐照小鼠胎肝造血干细胞移植后存活情况见表1：表1亚致死量辐照小鼠胎肝造血干细胞移植后存活情况由表1可以看出，1×107注射组的造血重建效果最好。受体鼠外周血涂片镜检结果如图1-3所示，荧光镜检观察，移植一周后的骨髓及外周血即出现GPF表达的细胞，且比例逐渐增多，至第七周趋于稳定；IMBI移植2个月后，同一只鼠的血涂片镜检发现，小细胞低色素贫血完全逆转成正细胞正色素性红细胞。致死量辐射654地贫小鼠IMBI2月后CD45.1/2+供体细胞在血细胞中嵌合率检测结果如图4所示，嵌合率为94.93±7.96％，基本上血细胞大部分被供体细胞取代，表明供体细胞替代了受体的造血干细胞，发挥了造血重建的功能。外周血血常规检测结果见表2：表2.致死量辐射654地贫小鼠IMBI2月后血常规检测由表2可以看出，IMBI胎肝MNC治疗654地贫后，RBC、Hgb、Hct、MCV、MCH、MCHC均显著上升，且接近于正常小鼠的血液学参数，由于细胞来源于供体细胞，表明供体细胞有效地发挥造血重建，维持稳定的血细胞供应功能。受体鼠骨髓细胞镜检和组织病理切片镜检结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)胎肝单细胞悬液制备：取哺乳动物胎肝，用枪头打碎成单细胞，细胞滤器过滤，除去细胞团块，用Ficoll分离液分离出单核细胞；(2)胎肝HSCs移植：配置单核细胞悬液，通过骨髓腔内注射方法，对受体进行骨髓腔内注射。

【技术特征摘要】
1.一种IBMI注射胎肝Ficoll分离单细胞悬液以重建造血的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)胎肝单细胞悬液制备：取哺乳动物胎肝，用枪头打碎成单细胞，细胞滤器过滤，除去细胞团块，用Ficoll分离液分离出单核细胞；(2)胎肝HSCs移植：配置单核细胞悬液，通过骨髓腔内注射方法，对受体进行骨髓...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾凡一，黄淑帧，杨冠恒，
申请(专利权)人：上海市儿童医院，上海滔华生物医药科技合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：上海,31