一种从颅骨中分离间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种从颅骨中分离间充质干细胞的方法，使用电动钻锯将5cm

【技术实现步骤摘要】
一种从颅骨中分离间充质干细胞的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种从颅骨中分离间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有自我更新和分化能力的成体干细胞，具有易于分离培养、多种因子分泌功能以及免疫调节功能等诸多优点，是目前干细胞领域的研究热点。诸多研究表明MSCs在组织损伤修复和各种疾病治疗方面有良好的应用前景，包括参与骨、软骨和肌腱等组织缺损修复、改善心肌梗死模型的心脏功能、降低急性肺损伤程度、促进糖尿病模型中的葡萄糖调节恢复、降低药物诱导的肝纤维化水平、以及促进神经元再生、皮肤再生和伤口愈合等。研究已经发现在髂骨、脐带、脂肪等多种组织中存在MSCs，但尚未见在颅骨中分离和鉴定MSCs的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足，提供一种从颅骨中分离间充质干细胞的方法。一种从颅骨中分离间充质干细胞的方法，其特征在于：使用电动钻锯将5cm3～15cm3颅骨骨片切碎至每片15～25立方毫米；加入20～30ml生理盐水，于低温摇床中慢摇，温度为4℃～10℃，转速为100～200转/分钟，摇10～15分钟；然后200～400目筛网过滤，收集滤液离心收集细胞；而后用细胞培养液悬浮细胞，所述的细胞培养液组成为含体积浓度1％～3％的血清替代物的MEM-alpha基础培养液；接种至细胞培养瓶中，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养；48小时后换液，除去未贴壁细胞；而后每2～3天换新鲜的细胞培养液，长至80％～90％汇合时，消化传代，P3代细胞收集鉴定，即为纯化的颅骨间充质干细胞。作为优选：所述筛网目数为200目。作为优选：收集滤液离心收集细胞时，滤液1000rpm离心6分钟。作为优选：所述的细胞培养液组成为含体积浓度2％的血清替代物的MEM-alpha基础培养液。作为优选：细胞培养液悬浮后，以2×105/cm2密度接种至25cm2塑料细胞培养瓶中。本专利技术的有益效果是:本专利技术所述方法从颅骨中快速高效分离得到具备典型特征的颅骨间充质干细胞，补充了间充质干细胞新的来源，有利于促进干细胞技术的研究和发展。附图说明图1为本专利技术分离获得的颅骨MSCs形态图。图2为本专利技术分离获得的颅骨MSCs流式细胞术检测表面标志图。图3为本专利技术分离获得的颅骨MSCs三系分化结果检测图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本专利技术。应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以对本专利技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本专利技术权利要求的保护范围内。实施例1：颅骨MSCs的分离培养将10cm3颅骨骨片用医用电动钻锯切碎后，转移至50ml离心管中，加入25ml生理盐水，混匀后，置于低温摇床中，于8℃，转速为150转/分钟条件下，摇15分钟，200目筛网过滤，滤液1000rpm离心6分钟，去除上清后，沉淀用细胞培养液悬浮，取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数后，以2×105/cm2密度接种至25cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，P3代细胞收集鉴定。实施例2：流式细胞术检测颅骨MSCs表面标志物取本专利技术方法获得的3代颅骨MSCs1.0×106，分别均匀分装成9管，离心后用PBS重悬至200μl，洗涤2次。离心后留1管做空白，表型标记按每管一个标记进行添加(抗体分别为小鼠抗人CD14-FITC、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-FITC、CD73-PE、CD90-PE和CD105-PE，购自BD公司)。暗室孵育30min，离心后洗涤2次，然后离心后加200μlPBS重悬，流式细胞仪测定。结果如图2所示，本专利技术方法所得的颅骨MSCs具有典型的MSCs表面标志物。实施例3：颅骨MSCs三系分化鉴定取本专利技术方法获得的3代颅骨MSCs各1.0×106，分为三组，分别进行脂肪、成骨和成软骨诱导分化，诱导21天后，进行检测，整个过程根据诱导试剂盒说明书进行操作(购自赛业生物科技有限公司)。结果如图3所示，本专利技术方法所得的颅骨MSCs能够向脂肪、成骨和成软骨诱导分化，具有三系分化潜能。综上结果表明，利用本专利技术方法能够从颅骨中分离得到MSCs，形态、表面标志物和三系分化鉴定均显示符合间充质干细胞鉴定标准，本专利技术提供了一种MSC新来源。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从颅骨中分离间充质干细胞的方法，其特征在于：使用电动钻锯将5cm3～15cm3颅骨骨片切碎至每片15～25立方毫米；加入20～30ml生理盐水，于低温摇床中慢摇，温度为4℃～10℃，转速为100～200转/分钟，摇10～15分钟；然后200～400目筛网过滤，收集滤液离心收集细胞；而后用细胞培养液悬浮细胞，所述的细胞培养液组成为含体积浓度1％～3％的血清替代物的MEM‑alpha基础培养液；接种至细胞培养瓶中，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养；48小时后换液，除去未贴壁细胞；而后每2～3天换新鲜的细胞培养液，长至80％～90％汇合时，消化传代，P3代细胞收集鉴定，即为纯化的颅骨间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种从颅骨中分离间充质干细胞的方法，其特征在于：使用电动钻锯将5cm3～15cm3颅骨骨片切碎至每片15～25立方毫米；加入20～30ml生理盐水，于低温摇床中慢摇，温度为4℃～10℃，转速为100～200转/分钟，摇10～15分钟；然后200～400目筛网过滤，收集滤液离心收集细胞；而后用细胞培养液悬浮细胞，所述的细胞培养液组成为含体积浓度1％～3％的血清替代物的MEM-alpha基础培养液；接种至细胞培养瓶中，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养；48小时后换液，除去未贴壁细胞；而后每2～3天换新鲜的细胞培养液，长至80％～90％汇合时，消化传...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢刚，麻育源，
申请(专利权)人：浙江省人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33